tlr4在小鼠腦出血炎癥損傷中的作用及機(jī)制初步研究

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1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文TLR4在小鼠腦出血炎癥損傷中的作用及機(jī)制初步研究姓名：鐘琪申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：楊清武201205第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文TLR4在小鼠腦出血炎癥損傷中的作用及機(jī)制初步研究2摘要腦出血(Imracerebralhemorrhage，ICH)為常見(jiàn)的急性腦血管病，約占腦血管疾病的10．30％，其發(fā)病率、病死率和致殘率高，是人類疾病主要死亡原因之一，約70％-80％的存活者遺留明顯殘疾，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。雖歷經(jīng)多年研究，但至今發(fā)病機(jī)制不甚清楚、治療手段有限。因此，深入研究其發(fā)病機(jī)制及防治措施，具有重要的臨床意義。越來(lái)越多的研究表明，

2、ICH發(fā)病最初并不是病情最嚴(yán)重的時(shí)期，在出血后幾天(一般2．3天)往往出現(xiàn)繼發(fā)性神經(jīng)損傷，引起腦損傷和神經(jīng)功能缺損加劇。因此，近年來(lái)有關(guān)腦出血繼發(fā)性損傷發(fā)病機(jī)制和防治研究成為熱點(diǎn)。目前認(rèn)為，紅細(xì)胞裂解產(chǎn)物誘發(fā)的炎癥反應(yīng)、血腫周圍代謝異常、血腫周圍局部腦血流量變化是導(dǎo)致神經(jīng)損傷加重的主要原因。特別是炎癥反應(yīng)具有重要作用而備受關(guān)注。已有研究證實(shí)，ICH后血腫周圍組織諸如小膠質(zhì)細(xì)胞等炎性細(xì)胞激活，釋放諸如TNF．Q、IL．1等致炎因子，細(xì)胞間粘附分子表達(dá)增加，加之血腦屏障破壞，外周中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向出血周邊區(qū)聚集，由此誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重腦水腫及神經(jīng)元死亡，最終導(dǎo)致腦損

3、傷和神經(jīng)功能缺損加劇。但至今仍不清楚腦出血導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的上游關(guān)鍵啟動(dòng)環(huán)節(jié)，即是紅細(xì)胞溶解產(chǎn)生的什么成分?作用于小膠質(zhì)細(xì)胞的什么受體?又是通過(guò)何種信號(hào)途徑產(chǎn)生的大量炎癥因子，誘發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)?TLRs(Toll．1ikereceptors)是一類介導(dǎo)天然免疫的古老受體，目前發(fā)現(xiàn)人有11種，分別命名為TLRl．11，為IL．1受體超家族成員，是歷經(jīng)數(shù)億年進(jìn)化而保存的宿主天然防御機(jī)制之一。TLR4作為內(nèi)毒素的跨膜受體在革蘭陰性菌感染、敗血癥休克中的重要作用已得到公認(rèn)。隨后新的證據(jù)表明，TLR4在腦缺血、老年性癡呆等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性損傷中具有重要作用。新近研究發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物血紅素(He

4、me)通過(guò)作用于巨噬細(xì)胞上的TLR4產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子，引起炎癥損傷，可能是出血性疾病引起組織損傷的重要機(jī)制。本研究應(yīng)用白體腦出血模型和體外小膠質(zhì)細(xì)胞成分刺激模型，定性定量研究TLR4的表達(dá)變化，TLR4敲除和被抑制后的炎癥變化以及血腫主要成分對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)影響。本課題探討TLR4在腦出血炎癥反應(yīng)中的作用及可能機(jī)制，試圖明確Heme／TLR4途徑是否是腦出血炎癥損傷的上游啟動(dòng)環(huán)節(jié)之一。2國(guó)家自然科學(xué)基金資助(81070932)第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文主要結(jié)果：1、小鼠腦出血模型成功率87％。造模后發(fā)現(xiàn)小鼠對(duì)側(cè)肢體癱瘓，運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)，行動(dòng)遲緩，自發(fā)左轉(zhuǎn)活動(dòng)。行為學(xué)評(píng)分顯示腦出血

5、對(duì)小鼠肢體運(yùn)動(dòng)有較大的影響，提示ICH造模成功。2、腦出血后研究發(fā)現(xiàn)TLR4mRNA在造模后第1天增加，在第3天達(dá)到高峰，在第5天下降，與小鼠神經(jīng)功能缺損程度呈正相關(guān)。3、應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腦未出血情況下血腫周圍組織中神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞極低表達(dá)TLR4，而腦出血造模成功情況下，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TLR4升高，但小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的TLR4顯著增加，變化最為顯著。4、敲除TLR4后，ICH3天時(shí)小鼠腦水腫顯著降低，血腫周圍的外周浸潤(rùn)細(xì)胞減少，行為學(xué)評(píng)分顯著低于WT腦出血組，血腫周圍組織炎癥因子TNF．0【、IL．1p和IL．6含量也顯著減少。5、應(yīng)用血腫主要成分Fe

6、2+，Heme，膽紅素等刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)僅Heme可顯著上調(diào)TLR4表達(dá)，小膠質(zhì)細(xì)胞活化且釋放的TNF一旺、IL一1D和IL．6等炎癥因子顯著增高，將Heme溶液注入小鼠紋狀體模擬腦出血模型發(fā)現(xiàn)，Heme可使小鼠肢體運(yùn)動(dòng)受損，腦水腫升高，炎癥因子TNF．0【、IL．113和IL．6釋放增多。而TLR4敲除后和TLR4特異性抗體能夠顯著抑制Heme的炎癥損傷效應(yīng)。主要結(jié)論：1、小鼠自體血注入紋狀體引發(fā)腦出血后，血腫邊緣小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4顯著上調(diào)，與神經(jīng)功能缺損呈正相關(guān)。2、敲除TLR4后，腦出血炎癥減弱，浸潤(rùn)細(xì)胞顯著減少，小鼠神經(jīng)功能缺損顯著降低，說(shuō)明T

7、LR4介導(dǎo)小鼠腦出血炎癥損傷。3、血腫主要成分Heme可引發(fā)離體小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4激活，介導(dǎo)炎癥因子釋放，造成炎癥損傷，表明Heme／TLR4是引起腦出血炎癥損傷的上游關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。抑制這一環(huán)節(jié)會(huì)減輕腦出血后炎癥損傷及神經(jīng)功能缺損，TLR4可望成為腦出血治療的新靶點(diǎn)。本研究初步闡明腦出血炎癥反應(yīng)造成肢體損傷的機(jī)制，揭示heme通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，造成肢體損傷，進(jìn)一步明確了腦出血炎癥損傷的上游關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并應(yīng)用拮抗抗體抑制heme引發(fā)的炎癥