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1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文丁苯酞對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠MMP--9活性和血腦屏障通透性的影響姓名：高蘭申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師：婁季宇；張燕柳201205摘要丁苯酞對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠MMP．9活性和血腦屏障通透性的影響研究生高蘭導(dǎo)師婁季宇張燕柳鄭州大學(xué)第二臨床學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科河南鄭州450014平煤集團(tuán)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科河南平頂山467000背景與目的隨著我國(guó)逐步步入老齡社會(huì)，缺血性腦血管病逐漸成為危害人類健康的多發(fā)病、常見病。高致病率、高復(fù)發(fā)率以及高致殘率為腦血管病的特點(diǎn)，給社會(huì)、家庭和個(gè)人帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。因此，探索積極有效的干預(yù)治療措施已成為目前研究的重點(diǎn)。腦動(dòng)脈閉
2、塞造成腦缺血，使局部腦組織血流下降或中止，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙或形態(tài)的破壞，立即恢復(fù)血流是關(guān)鍵。但是，伴隨恢復(fù)血流發(fā)生的再灌注損傷也不可忽視。所謂的缺血再灌注損傷(isehemiareperfusioninjury)是指缺血的組織器官在一定的時(shí)間后，雖然恢復(fù)血供，組織損傷，器官功能障礙沒有減輕，臨床癥狀甚至有進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。目前研究認(rèn)為：缺血再灌注損傷病理生理過程中至關(guān)重要的是血腦屏障(bloodbrainbarrier,BBB)的完整性。血腦屏障(BBB)是存在于腦組織和血液之間的一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)，由中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接、基底膜以及毛細(xì)血管基底膜外的星形膠質(zhì)細(xì)胞
3、終足構(gòu)成，其能控制血、腦兩側(cè)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，保證中樞神經(jīng)組織內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。其中血管基底膜主要由細(xì)胞外基質(zhì)分子(ECM)組成，主要成分包括lv型明膠原、層粘連蛋白和纖粘連蛋白，對(duì)維持血腦屏障(BBB)的完整性摘要至關(guān)重要。近年來研究認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，尤其是MMP．9在血腦屏障的開放機(jī)制方面具有更重要的意義。給予外源抑制劑抑制MMP一9活性，可減少大鼠腦缺血后的腦梗死體積；腦損傷中，MMP．9的表達(dá)過度活躍，可以通過降解神經(jīng)血管基質(zhì)，進(jìn)而損傷血腦屏障(BBB)iJI起腦水腫和出血。MMP-9底物主要為細(xì)胞外基質(zhì)中IV型膠原，又稱為IV型膠原酶。因此，尋找以基質(zhì)金屬蛋白酶@MMP
4、．9及其底物血管基底膜IV型膠原(collagenlV)為作用靶點(diǎn)，進(jìn)而減輕血腦屏障的通透性，減輕腦損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)劑作用意義重大。丁苯酞是從芹菜種籽中分離出的有效成分。可分為左旋丁基苯酞(1．NBP)、右旋丁基苯酞(d．NBP))3捎旋丁基苯酞(d1．NBP)，經(jīng)合成的消旋化合物為黃色油狀液體，具芹菜香味。已應(yīng)用于缺血性腦血管病的治療，本品可改善卒中發(fā)生后的神經(jīng)功能缺損癥狀，促進(jìn)患者功能恢復(fù)。但其在治療局灶性腦缺血再灌注損傷中的分子機(jī)制尚未完全闡明。既往研究對(duì)腦缺血再灌注損傷的機(jī)制多側(cè)重于其對(duì)清除氧自由基、抗凋亡和抗炎癥反應(yīng)的作用。但是對(duì)局灶腦缺血再灌注損傷中MMP．9活性、基底膜I
5、V膠原及血腦屏障通透性的影響還不清楚。本研究通過參照并改進(jìn)ZeaLonga線栓法，制備SD大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注損傷模型，觀察缺血側(cè)大鼠腦組織MMP．9活性、基底膜成分IV型膠原表達(dá)、BBB通透性的變化，以及丁苯酞治療后的效果。進(jìn)一步探索丁苯酞對(duì)腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。材料與方法健康成年雄性SD大鼠90只，體重240"--2809，參照ZeaLonga線栓法，并加以改進(jìn)制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組30只(sham)，缺血再灌注損傷組30只(MCAO／R)，丁苯酞治療組30只(NBP)。每組按再灌注時(shí)間不同各設(shè)3個(gè)亞組：6h、12h、24
6、h，每個(gè)亞組lO只大鼠。其中5只用于免疫組織化學(xué)測(cè)定，另外5只大鼠進(jìn)行血腦屏障通透性的研究。丁苯酞膠囊以0．5％Tween80鋁l成10m∥rnl混懸液，治療組以再灌注后5min用于動(dòng)物腹腔注射丁苯酞80mg／kg。假手術(shù)組不給藥，模型組給予相應(yīng)體積的生理鹽水(1ml&g)。在預(yù)訂時(shí)間點(diǎn)處死前30min經(jīng)舌下靜脈注射伊文思藍(lán)(2％EB，2ml／kg)。30min后相應(yīng)時(shí)問點(diǎn)處死大鼠，用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定損傷腦組織中MMP．9蛋白及collagenIV膠原，通過測(cè)定損傷腦組織中EB含量來觀察BBB通透性的變化。分析采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)4-標(biāo)準(zhǔn)羞(Z
7、士s)表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，任意兩組之問的比較采用LSD檢驗(yàn)。II摘要P<0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)甲二日7尺1MMP-9活性表達(dá)：假手術(shù)組腦內(nèi)MMP．9的陽性細(xì)胞數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均比較低；缺血再灌注組MMP．9的陽性細(xì)胞數(shù)6h可見少量表達(dá)，12h持續(xù)增加，24h更為顯著，各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P
