DB32∕T 2957-2016 鯉皰疹病毒Ⅱ型PCR檢測方法

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1、ICS65.150B50備案號：51404-2016DB32江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T2957-2016鯉皰疹病毒Ⅱ型PCR檢測方法PCRinspectionspecificationofcyprinidherpesvirusⅡ2016-09-20發(fā)布2016-11-20實(shí)施江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB32/T2957-2016前言本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1–2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》要求進(jìn)行編寫。本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省海洋與漁業(yè)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省水生動物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳輝、袁銳、方蘋、倪金俤、劉訓(xùn)猛、陳靜、郭立新、吳亞鋒I

2、DB32/T2957-2016鯉皰疹病毒Ⅱ型PCR檢測方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鯉皰疹病毒Ⅱ型（cyprinidherpesvirusⅡ）檢測方法的試劑和材料、儀器和設(shè)備、采樣、檢測步驟和結(jié)果判斷。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鯽魚皰疹病毒病病原的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法SC/T7014-2008水生動物產(chǎn)地檢疫采樣技術(shù)規(guī)范3試劑和材料3.1水符合GB/T6682-2008中一級水的規(guī)格。(該

3、水用來配置規(guī)范性附錄A中所列試劑)3.2無水乙醇3.3十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）3.4TaqDNA聚合酶及配套的10×PCR緩沖液TaqDNA聚合酶或ExTaqDNA聚合酶，生化試劑，-20℃保存。10×PCR緩沖液為該酶配套的相應(yīng)反應(yīng)緩沖液，生化試劑，-20℃保存。3.5MgCl2（25mmol/L）：生化試劑，-20℃保存。3.6dNTPs混合物含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10mmol/L的混合物，-20℃保存。3.75×TBE電泳緩沖液（按附錄A的規(guī)定）。3.86×DNA上樣緩沖液（按附錄A的規(guī)定）。3.9引物及擴(kuò)增片段鯉皰疹病毒Ⅱ型DNA聚合酶基因

4、擴(kuò)增引物：P1：5’-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3’，P2：5’-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3’。擴(kuò)增片段大小為362bp。注：該引物為擴(kuò)增鯉皰疹病毒Ⅱ型DNA聚合酶基因的通用引物。3.10DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)1DB32/T2957-2016宜使用DNAmarker2000，各片段大小依次為：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，也可使用其他合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。3.11陽性對照陽性對照為已知受鯉皰疹病毒Ⅱ型感染，且PCR檢測結(jié)果為鯉皰疹病毒Ⅱ型陽性并經(jīng)測序驗(yàn)證的DNA模板，-20℃保存。3.12陰性對照好陰

5、性對照為已知未受鯉皰疹病毒Ⅱ型感染，且PCR檢測結(jié)果為鯉皰疹病毒Ⅱ型陰性的組織，提取DNA，-20℃保存。3.13空白對照滅菌雙蒸水（無DNA酶）。3.14核酸染色劑TMGoldview核酸染料或其他宜使用的核酸染料。4儀器和設(shè)備4.1臺式高速離心機(jī)：最高轉(zhuǎn)速可達(dá)12000rpm以上。4.2普通冰箱：具有冷藏箱，-20℃以下冷凍箱體。4.3PCR儀。4.4電泳儀：輸出直流電壓0-600V。4.5水平電泳槽。4.6凝膠成像儀。4.7水浴鍋或者金屬浴。5采樣5.1采樣數(shù)量按SC/T7014-2008中6.1的規(guī)定執(zhí)行。5.2個體要求活魚或?yàn)l死的魚。5.3采樣部位有臨床癥狀的魚，如

6、體長不超過4cm，取鰓；體長為4cm~6cm，取鰓和內(nèi)臟（包括腎）；體長大于6cm，則取腦、肝、腎、脾和鰓組織。無癥狀的魚取腎、脾、鰓和腦組織。性成熟雌魚還需取卵巢液。2DB32/T2957-20165.4操作要求5.4.1采樣及樣品前處理過程中應(yīng)戴一次性手套，樣本間不得交叉污染。5.4.2鑷子，剪刀等取樣工具需要進(jìn)行滅菌（濕熱滅菌為121℃，20min；干燥滅菌為160℃，3小時）。5.4.3實(shí)驗(yàn)室以外的環(huán)境下采得的組織樣品需用液氮及時保存。6檢測步驟6.1DNA抽提6.1.1取100mg左右待檢新鮮組織與300μLCTAB溶液研磨勻漿，置于1.5mL離心管內(nèi)。加入450u

7、LCTAB溶液并混勻，65℃放置2h。6.1.2加入600μL酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）至樣品離心管中，持續(xù)上下顛倒用力混合至少1min，12000r/min4℃離心10min，小心取上層水相（約700μL）置于新的1.5mL離心管中。6.1.3加入700μL氯仿-異戊醇（24:1），用力混合至少30s，12000r/min4℃離心5min，小心取上層水相（約600μL）置于新的1.5mL離心管中。6.1.4加入-20℃預(yù)冷的1.5倍體積無水乙醇（約900μL），倒轉(zhuǎn)數(shù)次混勻后，置-20℃沉淀1