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1、InhibifionofP西oniexpressionbyRNAInterfefenceThesissubmittedtodaoAgriculturalUniversityInFulf'dlmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomySongShaokang(CollegeofAnimalScienceandVerterinaryMedicine)Supervisor：Prof．DongYajuanBaiXuejinQingdao．ChinaJun
2、e，2012學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明IIIIIIIIRillUlIIIIIlY2333091本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。如不實(shí)，本人負(fù)全部責(zé)任。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)
3、印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)學(xué)校可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū))學(xué)位論文作者簽名：導(dǎo)師簽簽字日期：年月日簽字日日。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文摘要RNAi抑制牛朊病毒表達(dá)的相關(guān)試驗(yàn)研究摘要牛海綿狀腦病俗稱瘋牛病，其主要癥狀是患牛精神狀態(tài)失常、共濟(jì)失調(diào)、感覺(jué)過(guò)敏和中樞神經(jīng)系統(tǒng)灰質(zhì)空泡化等。瘋牛病給世界的畜牧業(yè)以及人們的生活帶來(lái)極大危害，經(jīng)濟(jì)損失慘重。瘋牛病的病原是朊病毒(PrP8釓它是由
4、機(jī)體正常的朊蛋白(PrP。)轉(zhuǎn)化而來(lái)，而PrP。是由朊蛋白基因(朋膽)編碼而來(lái)，有試馳正明PrP。的存在是朊病毒感染的基礎(chǔ)。一方面由于機(jī)體正常的朊蛋白是固定在細(xì)胞膜上竹，提取純化較為困難，為了進(jìn)一步在細(xì)胞水平上研究牛朊蛋白的生理生化作用和朊蛋白疾病的發(fā)病機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在體外構(gòu)建了表達(dá)PRNP基因的真核表達(dá)載體；另一方面由于RNAi能夠在細(xì)胞中高效特異的降解與其序列同源的mlINA，誘導(dǎo)特定靶基因的沉默，一從而達(dá)到實(shí)現(xiàn)基因敲除或敲低的目的，因此，我們可以利用RNAi來(lái)敲低牛PrP。的量，從而使牛因缺乏轉(zhuǎn)化的
5、底物而可能具有抵抗朊病毒病的能力。采用重疊延伸PCR法(SOE-PCR)全基因合成牛朋胗基因的cDNA，并克隆到真核表達(dá)載體pDsRED2-NI中，得到牛PRNP基因真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染牛骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)，并用800弘g／mLG418對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選。結(jié)果顯示通過(guò)SOE-PCR成功擴(kuò)增了牛腳膽基因的cDNA，并構(gòu)建成真核表達(dá)載體，得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的刪SC細(xì)胞。利用RNAi技術(shù)，根據(jù)牛源PRNP基因cDNA設(shè)計(jì)3段SiRNA序列和1個(gè)陰性對(duì)照序列，分別將其連接到RNA干擾載體pRNA
6、T-U6．1／Neo上構(gòu)建成shRNA載體，并將shRNA載體轉(zhuǎn)染牛骨髓間充質(zhì)千細(xì)胞(BMSC)；通過(guò)Rea1-timePCR和Westernblotting篩選抑制效果最佳的載體，并用800“g／mLG418對(duì)轉(zhuǎn)染最佳載體的細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選。結(jié)果顯示成功構(gòu)建了3個(gè)靶向shRNA載體和1個(gè)陰性對(duì)照shRNA載體；3個(gè)靶向shRNA載體在不同時(shí)間段均在一定程度上下調(diào)了PRNPmRNA的表達(dá)，抑制了朊蛋白．PrP。的生成，得到了一個(gè)最佳干擾載體sh3；通過(guò)藥物篩選出了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh3載體的細(xì)胞單克隆。本研究獲
7、得了牛朋艫基因真核表達(dá)載體和有效抑制朊蛋白基因表達(dá)的sh3載體，篩選出穩(wěn)定表達(dá)腳咿基因和sh3載體的細(xì)胞單克隆，上述結(jié)果可為抗瘋牛病的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：瘋牛?。黄搽玫鞍?；shRNA；BidSC；SOE—PCR青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文摘要Inhib讞onofPrionexpressionbyRNAInterferenceAbstractBovinespongiformencephalopathycommonlyknown硒madcowdisease，themainsymptomsarethebovi
8、nesufferingfrommentalstatedisorders，ataxia,hyperesthesiaandcentralnervol／ssystemgraymattervacuolizationandsoon．Themadcowdiseasecausesgreatharmtotheworld’sanimalhusbandry勰welltopeople。slives．a(chǎn)ndbringsheavyeconomic10sses．The
