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1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文廣州管圓線蟲(chóng)感染宿主“酸腦”形成及調(diào)控機(jī)制的研究姓名：張二朋申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：潘長(zhǎng)旺；梁韶輝；黃慧聰2012-05-22溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文廣州管圓線蟲(chóng)感染宿主“酸腦”形成及調(diào)控機(jī)制的研究中文摘要目的1．建立感染廣州管圓線蟲(chóng)的ICOSL√一小鼠(CD275敲基因鼠)和C57BL／6小鼠模型，觀察其脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞上協(xié)同刺激因子表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)合不同感染時(shí)期腦組織的病理分析結(jié)果，探索與疾病發(fā)生發(fā)展可能相關(guān)的免疫學(xué)機(jī)制。2．收集不同感染時(shí)期小鼠的脾淋巴細(xì)
2、胞，并誘導(dǎo)其細(xì)胞因子的表達(dá)，觀察小鼠血清中IgG、IgGl、IgG2a的動(dòng)態(tài)變化，分析ICOS及其配體對(duì)Thl／Th2極化的影響，探索廣州管圓線蟲(chóng)病的分子機(jī)制及宿主的相關(guān)調(diào)控作用。方法1．構(gòu)建廣州管圓線蟲(chóng)III期幼蟲(chóng)感染的ICOSL√一小鼠CD275敲基因鼠和C57BL／6小鼠模型。2．分離不同感染時(shí)期小鼠脾CD4+T淋巴細(xì)胞2．1觀察不同病期細(xì)胞表面協(xié)同刺激信號(hào)。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的熒光，表達(dá)的陽(yáng)性比例用EXP30ADC軟件進(jìn)行分析，其結(jié)果用SPSSl7．0采用廣義線性模型的單變量分析其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2．2同時(shí)
3、體外培養(yǎng)脾CD4+T淋巴細(xì)胞。分別加入廣州管圓線蟲(chóng)V期幼蟲(chóng)可溶性抗原和ConA活化細(xì)胞后，干預(yù)共刺激信號(hào)。培養(yǎng)72小時(shí)后，收集細(xì)胞上清。ELISA法測(cè)定上清中IFN一口、IL—12、IL一4、IL一5和IL一13等細(xì)胞因子表達(dá)水平。3．感染小鼠眼眶取血，收集血清。ELISA法測(cè)定血清中IgG、IgGl和IgG2a的水平。4．ELISA法測(cè)定的細(xì)胞上清中細(xì)胞因子表達(dá)水平和血清中抗體水平的結(jié)果用SPSSl7．0采用廣義線性模型的單變量分析其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5．取不同感染時(shí)期小鼠腦組織，冰凍切片后進(jìn)行HE染色和DAB染色
4、。觀察兩種小鼠腦組織的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和協(xié)同刺激分子表達(dá)水平。ImageJ軟件分析免疫組化結(jié)果。結(jié)果1．感染后ICOSL√一組的淋巴細(xì)胞上協(xié)同刺激分子產(chǎn)生明顯滯后，感染后3周才出現(xiàn)顯著性差異；而C57BL／6組針對(duì)AC急性感染，感染后3天即出現(xiàn)顯著性差異。表明廣州管圓線蟲(chóng)感染不同時(shí)期小鼠脾CD4+T細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答與ICOS存在密切關(guān)系，ICOS也是Th2極化重要的共刺激分子。溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文2．C57BL／6組感染早期出現(xiàn)IFN-D、IL-12增高現(xiàn)象，血清抗體亞型水平隨著感染逐漸增高，預(yù)示感染兩周內(nèi)T
5、hl免疫應(yīng)答水平占優(yōu)勢(shì)，隨之逐漸被Th2免疫應(yīng)答水平取代；而ICOSL缺乏組Thl型細(xì)胞因子IFN一口、IL—12的升高均相對(duì)滯后，在感染早期Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL一5、IL一13的表達(dá)量相對(duì)增高。3．結(jié)合血清學(xué)抗體檢測(cè)結(jié)果觀察，ICOSL缺乏組與C57BL／6組相比，前者參與體液免疫的能力較差，較低的IgGl和IgG2a水平顯示ICOSL缺乏組在保護(hù)性免疫的產(chǎn)生過(guò)程的信號(hào)傳導(dǎo)通路受阻，無(wú)法快速組織有效的Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答。4．腦組織切片經(jīng)HE染色后光鏡下進(jìn)行初步組織形態(tài)學(xué)觀察：正常對(duì)照鼠切片中細(xì)胞形態(tài)一致
6、，細(xì)胞核完整染成均一藍(lán)色；感染小鼠切片中細(xì)胞胞體變小、變圓，細(xì)胞核固縮、深染。5．ICOSL√一組腦組織切片經(jīng)DAB染色發(fā)現(xiàn)協(xié)同刺激分子表達(dá)出現(xiàn)明顯滯后現(xiàn)象，感染后3周才出現(xiàn)顯著性差異；而C57BL／6組針對(duì)AC急性感染，感染后2周即出現(xiàn)顯著性差異。表明ICOS的缺陷可延后免疫病理反應(yīng)的發(fā)生。結(jié)論本項(xiàng)研究獲得了廣州管圓線蟲(chóng)感染小鼠致病過(guò)程中CD4+T淋巴細(xì)胞協(xié)同刺激分子動(dòng)態(tài)表達(dá)特征，推測(cè)其與“酸腦"發(fā)生發(fā)展的可能關(guān)系；發(fā)現(xiàn)干預(yù)ICOS介導(dǎo)的協(xié)同刺激信號(hào)可調(diào)控Thl／Th2的極化，為探索以協(xié)同刺激分子為靶點(diǎn)的調(diào)控
7、機(jī)制及尋找控制“酸腦"的發(fā)生發(fā)展的策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。關(guān)鍵詞：廣州管圓線蟲(chóng)；協(xié)同刺激因子；細(xì)胞因子；免疫組化；流式細(xì)胞術(shù)溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文StudyontheFormationofEosinophilicMeningitisandtheRegplationMechanismintheHostofAngiostrongyluscantonensisABSTRACTobjective1．EstablishthemodelofICOSL√-mice(CD275knockoutmice)andC57BL／6micei
8、nfectionwithAngiostrongyluscantonensis，observethedynamicchangeoftheCO-stimI-tlatoryfactorexpressionofCD4+Tlymphocytes，andcombinethepathologicalanalysisofbraintissuesindifferentperiodofinfection，
