包涵體的分離純化

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1、包涵體的純化和復(fù)性總結(jié)（二）關(guān)于包涵體的純化是一個(gè)令人頭疼的問(wèn)題，包涵體的復(fù)性已經(jīng)成為生物制藥的瓶頸，關(guān)于包涵體的處理一般包括這么幾步：菌體的破碎、包涵體的洗滌、溶解、復(fù)性以及純化，內(nèi)容比較龐雜一、菌體的裂解1、怎樣裂解細(xì)菌？?細(xì)胞的破碎方法?1.高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開(kāi)動(dòng)開(kāi)關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動(dòng)物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。2.玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng)，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程

2、度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。3.超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點(diǎn)是在處理過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施，時(shí)間以及超聲間歇時(shí)間、超聲時(shí)間可以自己調(diào)整，超聲完全了菌液應(yīng)該變清亮，如果不放心可以在顯微鏡下觀察。對(duì)超聲波及熱敏感的蛋白和核酸應(yīng)慎用。4.反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)

3、冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。5.化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好，我用的濃度一般為1mg/ml。無(wú)論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會(huì)使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是

4、全部，而且應(yīng)該在破碎的同時(shí)多加幾次；另外，還可通過(guò)選擇pH、溫度或離子強(qiáng)度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。?這是標(biāo)準(zhǔn)配方:裂解液：50mM?Tris-HCl(pH8.5~9.0),?2mM?EDTA,?100mM?NaCl,?0.5%?Triton?X-100,?1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在這個(gè)pH范圍內(nèi)比較好發(fā)揮作用)但我個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)是:如果你裂解細(xì)菌是為了提取蛋白的話,而且蛋白的分子量又小于20kd的話,盡量減少溶菌酶的用量,會(huì)引入溶菌酶這種雜蛋白.一般配60ml裂解液用藥匙匙柄盛一點(diǎn)就夠.判斷裂

5、解好壞的標(biāo)準(zhǔn)是,溶液很粘.protocol是10ml-50ml緩沖液(菌體洗滌液,裂解液等)/1g濕菌體.如果只做一個(gè)鑒定,我覺(jué)得100-200ml菌就夠了.但凡超聲,我都用60ml裂解液,因?yàn)槲覀兊某晝x(現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)錄象里的那種)很適合用100ml小燒杯,裝60ml裂解液,這樣能讓超聲頭離液面不高不低,不會(huì)冒泡泡,也不會(huì)灑出來(lái).菌多我就延長(zhǎng)超聲時(shí)間.沉淀,也就是包涵體沉淀了,如果要上柱純化,一定要先用4M尿素洗滌一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑電泳,可以直接用8M尿素溶解以后,離心取上

6、清,加入適量體積的loading?buffer.loading?buffer對(duì)于包涵體的溶解能力是較弱的."取200微升菌液，離心后直接加上樣buffer，100度3分鐘后上樣，然后SDSPAGE.?這個(gè)方法到底能不能溶解細(xì)菌中的包涵體??"而樓主的問(wèn)題,雖然loading?buffer對(duì)于包涵體的溶解能力是較弱的,但是我覺(jué)得你的做法只是在鑒定有無(wú)表達(dá),用loading?buffer是沒(méi)有問(wèn)題的.?2、表達(dá)重組蛋白時(shí)，細(xì)菌裂解方法都有哪些？?在表達(dá)重組蛋白時(shí)，誘導(dǎo)以后跑SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)表達(dá)都很好，但是在裂

7、解細(xì)胞時(shí)遇到問(wèn)題?？偸遣荒軓氐琢呀饧?xì)胞。首先我采用超聲裂解，可是不管我如何超聲總有部分細(xì)菌沒(méi)有裂解。我的超聲條件如下：寧波新芝超聲細(xì)胞破碎儀，功率400W，超5秒，間隔5秒，重復(fù)99次。然后顯微鏡觀察，不徹底時(shí)再重復(fù)99次。菌體來(lái)自200?ml培養(yǎng)液，用20?ml?PBS重懸。然后我又嘗試加溶菌酶，首先加至終濃度100?ug/ml，4C半小時(shí)菌液不變粘，加大濃度至1?mg/ml，半小時(shí)后仍無(wú)明顯變化。因?yàn)槲矣玫腜BS是pH7.4，我懷疑是pH不合適，換用pH8.0?TE?buffer，1?mg/ml溶菌酶，4

8、C半小時(shí)仍無(wú)明顯變粘。因?yàn)檫@次使用的溶菌酶是前一天配好的，擔(dān)心溶菌酶失效，重新稱取凍干粉末，直接加入菌液，仍然沒(méi)有明顯變化。真是郁悶。到底出了什么事？請(qǐng)高手解答，并介紹優(yōu)化的方案。同時(shí)希望能介紹一下如何選擇細(xì)胞破碎方法，以及如何確定最佳條件。溶菌酶在pH7.4時(shí)是否沒(méi)有活性了？可否配成濃縮液保存溶菌酶，如果可以，應(yīng)如何保存？?加入溶菌酶以后，如果細(xì)胞壁已破壞，菌液應(yīng)該變粘吧，因?yàn)楹怂岜会尫懦鰜?lái)。而超