枯草芽孢桿菌產(chǎn)胞外淀粉酶高產(chǎn)菌株的選育講義

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1、枯草芽孢桿菌產(chǎn)胞外淀粉酶高產(chǎn)菌株的選育在以微生物為材料的遺傳學(xué)研究中，用某些物理因素或化學(xué)因素處理微生物，使基因發(fā)生突變，可能導(dǎo)致微生物提高或者減低合成某一物質(zhì)的能力。物理誘變劑常用的有X射線、紫外線、快中子、γ射線等。誘變處理首先是選擇誘變劑，微生物誘變中最常用的物理誘變劑是紫外線。用誘變劑處理微生物，一般要求微生物呈單核的單細(xì)胞或單孢子的懸浮液，分布均勻，這樣可以避免出現(xiàn)不純的菌落。用于誘變處理的微生物一般處于對數(shù)生長期，處于該期的細(xì)菌對誘變劑最敏感。必須選擇合適的劑量進(jìn)行誘變處理，劑量的表示

2、有二種，絕對劑量和相對劑量。絕對劑量的單位以爾格/cm2表示，一般用相對劑量。相對劑量與3個(gè)因素有關(guān)：誘變源和處理微生物的距離、誘變源（紫外燈）的功率、處理的時(shí)間。前2個(gè)因素是固定的，所以通過處理時(shí)間控制誘變劑量。處理不同微生物的最適劑量是不同的，須經(jīng)預(yù)備實(shí)驗(yàn)確定。本綜合實(shí)驗(yàn)利用紫外線誘變枯草芽孢桿菌懸浮的菌體，分析不同參數(shù)下的紫外線致死率及誘變率，篩選產(chǎn)量提高的產(chǎn)淀粉酶菌株。學(xué)習(xí)物理因素誘變育種的方法，并掌握分光光度法測定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法，最終從誘變菌株中篩選出淀粉酶活力較高的菌

3、株。實(shí)驗(yàn)一紫外誘變及高產(chǎn)菌株的初篩（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^實(shí)驗(yàn)，觀察紫外線對枯草芽孢桿菌的誘變效應(yīng)，并學(xué)習(xí)物理因素誘變育種的方法。（二）實(shí)驗(yàn)材料與用品菌種：枯草芽孢桿菌(產(chǎn)胞外淀粉酶)；儀器：血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，紫外線燈（15W），電磁攪拌器，離心機(jī)。（三）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法（1）菌懸液的制備a)取培養(yǎng)48小時(shí)的枯草芽孢桿菌的斜面4—5支，用無菌生理鹽水將菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角燒瓶中，振蕩30分鐘，以打碎菌塊。b)將上述菌液離心（3000r/min，離心15分鐘），棄去上清液，將菌體用無菌生理鹽

4、水洗滌2—3次，最后制成菌懸液。c)用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升108個(gè)。（2）平板制作將淀粉瓊脂培養(yǎng)基溶化后，冷至55℃左右時(shí)倒平板，凝固后待用。（3）紫外線處理4a)將紫外線燈開關(guān)打開預(yù)熱約20分鐘。b)取直徑6cm無菌平皿2套，分別加入上述菌懸液5ml，并放入無菌攪拌棒于平皿中。c)將盛有菌懸液的2平皿置于磁力攪拌器上，在距離為30cm，功率為15W的紫外線燈下分別攪拌照射1分鐘及3分鐘。（4）稀釋在紅燈下，將上述經(jīng)誘變處理的菌懸液以10倍稀釋法稀釋成10-1-10-6（具體

5、可按估計(jì)的存活率進(jìn)行稀釋）。（5）涂平板取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度涂平板，每個(gè)稀釋度涂平板3只，每只平板加稀釋菌液0.1ml，用無菌玻璃刮棒涂勻。以同樣操作，取未經(jīng)紫外線處理的菌稀釋液涂平板作對照。（6）培養(yǎng)將上述涂勻的平板，用黑布（或黑紙）包好，置37℃培養(yǎng)48小時(shí)。注意每個(gè)平皿背面要標(biāo)明處理時(shí)間和稀釋度。（7）計(jì)數(shù)將培養(yǎng)48小時(shí)后的平板取出進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，根據(jù)對照平板上菌落數(shù)，計(jì)算出每毫升菌液中的活菌數(shù)。同樣計(jì)算出紫外線處理1分鐘、3分鐘后的存活細(xì)胞數(shù)及其致死率。（8）觀察誘變效應(yīng)

6、將細(xì)胞計(jì)數(shù)后的平板，分別向菌落數(shù)在5—6個(gè)左右的平板內(nèi)加碘液數(shù)滴，在菌落周圍將出現(xiàn)透明圈。分別測量透明圈直徑與菌落直徑并計(jì)算其比值（HC值）。與對照平板進(jìn)行比較，根據(jù)結(jié)果，說明誘變效應(yīng)。并選取HC比值大的菌落移接到試管斜面上培養(yǎng)。（四）實(shí)驗(yàn)作業(yè)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果并進(jìn)行討論，撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。實(shí)驗(yàn)二高產(chǎn)菌株的鑒定（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．掌握分光光度法測定液化型淀粉酶活力的基本原理和方法；2．從初篩所獲得的誘變菌株中篩選出淀粉酶活力高的菌株。（二）實(shí)驗(yàn)原理淀粉酶是指能催化分解淀粉分子中糖苷鍵的一類酶，包

7、括α-淀粉酶、淀粉1，4-麥芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉1，4-葡萄糖苷酶（糖化酶）和淀粉1，6-葡萄糖苷酶（異淀粉酶）。α-淀粉酶可以從淀粉分子內(nèi)部切斷淀粉的α-1，4糖苷鍵，形成麥芽糖、含6個(gè)葡萄糖單位的寡糖和帶有支鏈的寡糖，使淀粉的粘度下降，因此又稱為液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈藍(lán)色。這種淀粉-碘復(fù)合物在660nm處有較大的吸收峰，可以用分光光度計(jì)測定。隨著酶的不斷作用，淀粉長鏈被4切斷，生成小分子糊精，使其對碘的藍(lán)色反應(yīng)逐漸消失，因此可以根據(jù)一定時(shí)間內(nèi)藍(lán)色消失的程度為指標(biāo)來測定α-淀粉酶的活力

8、。（三）實(shí)驗(yàn)用品1．粗酶液實(shí)驗(yàn)一保存的HC比值大的菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵液離心后可作為粗酶液。2．試劑碘原液：稱取碘化鉀22g，加少量蒸餾水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500ml，貯于棕色瓶中；比色用稀釋碘液：取碘原液2ml，加碘化鉀20g，用蒸餾水定容至500ml，貯于棕色瓶中；2%可溶性淀粉：稱取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g，用少量蒸餾水混合調(diào)勻，徐徐傾入煮沸的蒸餾水中，邊加邊攪拌，煮沸2min后冷卻，加水定容至100ml，需當(dāng)天配制；pH6.0的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液：