哈茨木霉高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選及其基因的克隆

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1、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文哈茨木霉高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株的篩選及其基因的克隆姓名：王紅梅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物物理學(xué)指導(dǎo)教師：蔣立科20090601中文摘要木霉(Trichoderma．．淵屬于半知菌類叢梗孢目，叢梗孢科真菌(Gloiosporae)是一種廣泛存在于土壤、植物根際和葉面的腐生型真菌，對(duì)多種植物病原真菌具有拮抗作用。因而被當(dāng)作為一種生防菌種進(jìn)行使用，并引起了眾多微生物學(xué)家和植物病害研究者的高度重視。一方面鑒于它能促進(jìn)作物生長(zhǎng)，另一方面因頻繁的生化作用的不穩(wěn)定性，迫使人們?nèi)ヌ骄吭颍源龠M(jìn)木霉菌在植物生防領(lǐng)域和促作物

2、生長(zhǎng)上的開發(fā)利用，為實(shí)現(xiàn)促進(jìn)木霉在生產(chǎn)應(yīng)用上提供充分的生物學(xué)依據(jù)。幾丁質(zhì)是自然界廣泛存在的生物多聚體，是構(gòu)成大多數(shù)真菌細(xì)胞壁的主要成分，而有些微生物分泌的幾丁質(zhì)酶有降解幾丁質(zhì)的作用，而達(dá)到防治真菌的目的。很多年來(lái)，農(nóng)業(yè)和林業(yè)上遇到的病害很大部分都是由昆蟲和真菌引起的，不難發(fā)現(xiàn)，這兩大類有個(gè)重要的共同點(diǎn)，就是其外殼都是由幾丁質(zhì)組成的。所以，在發(fā)現(xiàn)了化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和人類造成的不可彌補(bǔ)的重大災(zāi)難后，人們把注意力朝向了生物防治，因而催化幾丁質(zhì)分解的主要酶——幾丁質(zhì)酶就自然地成了研究的重點(diǎn)。因此，不斷去尋找篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物，并純化

3、其所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶，研究其性質(zhì)、作用方式、作用效果及分子機(jī)理，以及轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因植物的研究發(fā)現(xiàn)，是目前生物防治研究中的一個(gè)新的熱點(diǎn)。本項(xiàng)研究主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：1．離子注入并篩選突變菌株：通過(guò)氮離子注入誘變哈茨木霉野生菌，再以透明圈法進(jìn)行平板培養(yǎng)菌的初篩和復(fù)篩，DNS法測(cè)定液體培養(yǎng)菌的酶活，從中篩選出一株高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株(編號(hào)為3．3)，確定為哈茨木霉新突變株(命名待定)。2．優(yōu)化篩選木霉菌株生長(zhǎng)條件：對(duì)所篩菌株進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)發(fā)酵的條件優(yōu)化。單因素分別是從培養(yǎng)基氮源、膠體幾丁質(zhì)濃度、發(fā)酵起始pH值、培養(yǎng)時(shí)間等方面進(jìn)行，

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加1％蛋白胨組的產(chǎn)酶量最高，1．0％膠體幾丁質(zhì)對(duì)菌體產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)性最強(qiáng)，初始pH5．5、培養(yǎng)96h時(shí)產(chǎn)酶量較高；正交試驗(yàn)綜合分析表明，哈茨木霉H-13接種于1％蛋白胨為氮源、0．5％膠體幾丁質(zhì)為碳源、初始pH5．0的培養(yǎng)基，培養(yǎng)96h時(shí)，發(fā)酵液中的幾丁質(zhì)酶活可達(dá)至U731．69U／mE，高于單因素條件中的任一因素，比野生菌株酶活力提高1倍。3．對(duì)突變菌株幾丁質(zhì)酶基因克隆：哈茨木霉是重要的生防菌，對(duì)多種病原菌均有很好的拮抗作用，其作用之一就是產(chǎn)生多種細(xì)胞壁降解酶，尤其是42kD幾丁質(zhì)酶。根據(jù)GenBank上已

5、有的42kD幾丁質(zhì)酶編碼基因序列設(shè)計(jì)適宜的引物，通過(guò)PCR技術(shù)，從哈茨木霉H一13基因組DNA中擴(kuò)增到相應(yīng)序列，通過(guò)GenBank進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列同已發(fā)表的其他Trichodermharzianum42kD幾丁質(zhì)酶序列具有99％的同源性，因此確定該序列為42kD幾丁質(zhì)酶編碼基因，堿基序列比對(duì)表明在編碼區(qū)內(nèi)有1l處堿基改變，導(dǎo)致6處氨基酸發(fā)生改變。4．進(jìn)行了對(duì)所篩選菌株發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用：在蚌埠懷遠(yuǎn)所進(jìn)行了大棚蔬菜種植實(shí)驗(yàn)，其萵筍、番茄增長(zhǎng)30％以上，水稻育秧狀況表現(xiàn)出較對(duì)照組的明顯旺盛。綜上可知，本研究首次采用離子注入誘變

6、的方法并獲得高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的木霉菌株，表明此方法的可行性，對(duì)于其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)植物增長(zhǎng)的事實(shí)，為木霉在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和生物防治方面的研究提供了支持和依據(jù)，幾丁質(zhì)酶基因的成功克隆，為轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展提供了理論依據(jù)。關(guān)鍵詞：哈茨木霉；氮離子注入；幾丁質(zhì)酶；產(chǎn)酶條件；基因擴(kuò)增II英文摘要Trichoderma．SPPbelongstoclusterstemcohortofDeuteromycetes．Gloio．,poraefungus．ItisakindofgenerallyexistentFunguswhichisatypicalrot

7、fungianditisarlantagonisticbacteriumofAgaricusspawndistresspathogensinthesoil，plantrootzoneandleafsurface．Trichodermaisattractedbymanymicrobiologistsandlearnersforit’SbiocontrolfactorsOilplantdiseases，positiveeffectsonpromotingplantgrowthandinhibitplantdiseases．Itis

8、necessarytostudyTrichodermaforit’Susefulfacts．．Thechitinisakindofbiopolymerwidespreadexistenteinthenature，whichisprincipalingredientstomak