實驗一 質(zhì)粒dna提取純化、dna電泳檢測

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1、實驗一質(zhì)粒DNA提取純化、DNA電泳檢測一、實驗目的1．掌握質(zhì)粒DNA的制備的原理和方法2．了解質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳分離二、實驗原理1．質(zhì)粒DNA的制備方法質(zhì)粒(Plasmid)是獨立存在于染色體外、能自主復制并能穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，分布于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，但在細菌細胞中含量最多。細菌質(zhì)粒大小介于1～200Kb之間，是應用最多的質(zhì)粒類群，在細菌細胞內(nèi)它們利用宿主細胞的復制機構(gòu)合成質(zhì)粒自身的DNA。質(zhì)粒DNA的制備包括3個步驟：①培養(yǎng)細菌，使質(zhì)粒DNA大量擴增；②收集和裂解細菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。主要方法包括：堿裂解法：0.2molNaOH+1%

2、SDS；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，一般用于質(zhì)粒大量提取。在實際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點以及質(zhì)粒DNA的用途進行選擇。本實驗選擇堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。2．堿裂解法質(zhì)粒DNA具特定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，在特殊的環(huán)境條件下，如加熱、極端pH值、有機溶劑、尿素、酰胺試劑等會導致質(zhì)粒DNA變性，去除變性條件又可以使DNA復性。堿裂解法根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離質(zhì)粒DNA。SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能裂解細菌細胞，又能使細菌蛋白質(zhì)變性。SDS處理細菌細胞后會導致細菌細胞壁破裂，從而使質(zhì)粒D

3、NA及細菌基因組DNA從細胞中同時釋放出來。細菌環(huán)狀基因組DNA在操作過程中會斷裂成線狀DNA分子，在pH值介于12.0～12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞結(jié)合在一起。當加入pH4.8乙酸鉀緩沖液時，pH恢復至中性，因為共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那么迅速而準確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而復性的質(zhì)粒DNA恢復原來構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。通過離心，就可去除染色體DNA和蛋白質(zhì)-

4、SDS復合物等物質(zhì)，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒DNA，乙醇或異丙醇沉淀就可得到純的質(zhì)粒DNA，之后可再用超離心、電泳、離子交換柱層析等方法進一步純化質(zhì)粒。3．質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳分離瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)（agarosegelelectrophoresis）是分離、鑒定和提純DNA片斷的有效方法。瓊脂糖凝膠可分辯0.1~6.0kb的雙鏈DNA片段。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子的高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的靜電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一

5、定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子，如pUC19質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：3超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)；開環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA1條鏈斷裂(opencircularDNA,OCDNA)和線狀質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2條鏈發(fā)生斷裂(li

6、nearDNA,LDNA)。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移速度不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。三、儀器及試劑1．儀器及耗材：冷凍離心機、微量移液器、1.5mlEP管、槍頭、凝膠槽、電泳儀等。2．試劑及配制：溶液Ⅰ（GET緩沖液）：25mmol/LTris-HCl（pH8.0），10mmol/LEDTA，50mmol/L葡萄糖，pH8.0溶液II（變性液）：200mmol/LNaOH，1%SDS配制：1ml10%SDS50μl1NNaOH200μl取以上溶液，用滅菌去離子水定容至1ml，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。溶液

7、III(醋酸鉀液)：3mol/L醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH5.6。5mol/L冰醋酸配制：100ml醋酸鉀29.4g冰醋酸11.5ml加入60ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后，再加去離子水將溶液定容至100ml。高溫高壓滅菌后，4℃保存。其它試劑：TE（pH8.0）、飽和酚、酚/氯仿（25：24）、無水乙醇、70％乙醇、電泳緩沖液、6×上樣緩沖液四、實驗步驟1．接種細菌于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜（Ecoli.Top10,pUC19質(zhì)粒）；2