人溶菌酶基因乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及其在小鼠乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

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1、Y977729分類號：Q21UDc：52Z密級：壘玨級⑧西北農(nóng)林針捉大學(xué)2006屆攻讀碩士學(xué)位研究生學(xué)位(畢業(yè))論文人溶菌酶基因乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及其在小鼠乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)學(xué)科專業(yè)筮直生物堂研究方向喧乳動麴艇臉王程研究生值塵寶指導(dǎo)教師韭涵麴援完成時間2壁豎生查且人溶菌酶基因乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及其在小鼠乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)摘要人溶菌酶(humanlysozyme，hLYZ)參與機體的防御機制，有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的作用，因此在醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)等領(lǐng)域得到十分廣泛的應(yīng)用。天然hLYZ一般是從

2、人乳、中性粒細(xì)胞或尿液中少量提取，但由于來源極其困難，提取方法復(fù)雜，且安全性得不到保障，不能進行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器具有表達(dá)水平高、表達(dá)產(chǎn)物活性強、易于純化和無污染等優(yōu)點，是大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白的新途徑。因此，本研究以奶牛B一酪蛋白基因調(diào)控區(qū)為指導(dǎo)元件，以人溶菌酶(hLYZ)cDNA為表達(dá)序列，構(gòu)建了乳腺特異性表達(dá)載體pEBH。轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)株，并對表達(dá)產(chǎn)物進行SDS—PAGE分析及Westernblot檢測。相關(guān)結(jié)果如下：1．通過RT-PCR技術(shù)成功

3、的從人胎盤組織中擴增出長度為853bp的hLYZ基因cDNA，包含完整的編碼序列。經(jīng)序列分析表明，片段與GenBank中登錄的人hLYZeDNA序列的同源性為99％。在讀碼框內(nèi)，只有三個堿基發(fā)生點突變。但分析表明，這三處突變不影響蛋白質(zhì)功能。2．利用定向克隆的方法，將hLYZ表達(dá)序列與改造好的初級乳腺表達(dá)載體pBCP融合在一起，然后定向克隆至真核表達(dá)載體pEGFP—C1中，最終構(gòu)建了含有抗性基因和綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因的hLYZ非融合型乳腺特異性表達(dá)載體pEBH。3．通過脂質(zhì)體法將表達(dá)載體p

4、EBH轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6，經(jīng)G418抗性篩選，得到的陽性細(xì)胞可穩(wěn)定地表達(dá)綠色熒光蛋白，并且主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。通過PCR法檢測了報告基因表達(dá)的陽性細(xì)胞，結(jié)果表明hLYZcDNA序列已整合到EMT6細(xì)胞染色質(zhì)中。4．轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖后經(jīng)激素誘導(dǎo)，培養(yǎng)液上清通過SDS—PAGE分析，在約14．7ku處出現(xiàn)了與預(yù)期目的蛋白相一致的外源蛋白帶。Westemblot檢測證明該蛋白是人溶菌酶。關(guān)鍵詞：人溶菌酶；乳腺特異性表達(dá)載體；轉(zhuǎn)染；小鼠乳腺癌細(xì)胞；WestemblotCONSTRUCTION0F

5、MA～口MARYGLAND—SPECIFICEXPRESS10NALVECTORANDEXPRESS10NINMOUSEBREASTCARCINOMACELLSFORHUMANLYSOZYMEABSTRACTHumanlysozyme(hLYZ)participateinthebodydefensemechanism．Itactsasashieldagainstbacterialinfectionandithaseffectsonmalignantgrowthandimmunoloregulation

6、．Soithaswideapplicationinmedicineandfoodstuffindustry．hLYZCanbepurifiedfromhumanbreastmilk，neutrophils，andurine．Becauseofthelimitationofitssourceandthecomplexityofitsextraction，andthepotentialriskoftransmittingpathogenstothenursinginfants，wecannotgetitb

7、ylarge—scale．SodevelopmentofsaferrecombinanthLYZisneeded．Animalmammaryglandbioreactorisanovelalternativestrategyforproductionofrecombinantproteinswithmanyadvantagesincludinghighproductioncapacities，easypurification，faithfultranslationalmodificationsanda

8、uthenticbiologicalactivitiesoftheexpressedproducts．Inthisresearch，themammarygland—specificexpressionvectorpEBHwasconstructed，whichwasconsistedofregulatingelementsregulationregionofbovine3-caseinandexpressionsequencehumanlysozymec