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1、南方醫(yī)科大學碩士學位論文大鼠脂肪基質細胞的分離培養(yǎng)及二步法誘導分化為神經細胞的實驗研究姓名：唐艷平申請學位級別：碩士專業(yè)：神經生物學指導教師：肖中舉;姜曉丹20090510碩士學位論文大鼠脂肪基質細胞的分離培養(yǎng)及二步法誘導分化為神經細胞的實驗研究碩士研究生：唐艷平指導老師：肖中舉教授姜曉丹教授摘要成體脂肪基質細胞(adipose．derivedstromalcells，ADSCs)是一類存在于脂肪組織中、具有多向分化潛能的干細胞，研究發(fā)現(xiàn)，它具有幾乎和胚胎干細胞(embryonicstemcells，ESCs)一樣具有較強的分化潛能，在一定誘導條件下，既可以向中胚層起源的成骨細胞、成軟骨
2、細胞、成肌細胞和脂肪細胞分化，也可以向外胚層起源的神經細胞分化，且至今為止尚未發(fā)現(xiàn)致瘤性。因其來源豐富且易于取材，將可彌補胚胎組織來源和成體中樞來源神經干細胞(neuralstemcells，NSCs)在應用上的困難如來源不足、采集困難、免疫排斥、法律倫理限制等，顯現(xiàn)了在中樞神經系統(tǒng)(centralnervesystem，CNS)疾病細胞移植治療領域的巨大潛能。本課題以大鼠ADSCs為研究對象，主要從ADSCs的分離培養(yǎng)和向神經細胞定向誘導分化的方法學上進行研究，探討建立一種簡便高效的由成體ADSCs在體外誘導培養(yǎng)獲得NSCs的方法，以期優(yōu)化成體ADSCs誘導分化實驗流程、提高定向分化比
3、例，從而解決NSCs移植的種子細胞來源不足、體外定向分化率低等問題，為細胞移植治療CNS疾病的臨床應用提供實驗基礎。中文摘要第一部分：大鼠ADSCs的體外培養(yǎng)擴增及其生物學特性的觀察目的：分離、純化、體外培養(yǎng)擴增大鼠ADSCs，并觀察其生物學特性。方法：無菌麻醉狀態(tài)下取SD大鼠的腹膜后脂肪組織，用剪刀剪碎并以I型膠原酶消化離心，以含10％胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基重懸細胞，接種于培養(yǎng)瓶，置于37℃、5％COs培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代，CK2型倒置光學相差顯微鏡下追蹤觀察活細胞培養(yǎng)生長情況并拍照；四唑鹽(methylthiazolyltetrazolium，MTT)法檢測細胞生長增殖情況，
4、繪制細胞生長曲線；流式細胞儀檢測及免疫熒光細胞化學染色(間接法)檢測CD34、CDl06、CD44、HLA-1等細胞表面標志。結果：倒置顯微鏡下觀察，剛接種的細胞大多呈圓球狀，懸浮在培養(yǎng)基中，可見少數(shù)脂滴懸在最上層；ADSCs原代有多種形態(tài)，有圓球狀、長梭形及成纖維樣。通過貼壁傳代法除去雜細胞，傳至第五代，細胞形態(tài)較為一致，呈長梭形，細胞排列整齊，有漩渦狀特征；在10％胎牛血清存在的條件下，傳代細胞每24h增殖1倍，并表達較強的CD44免疫細胞化學陽性染色。流式細胞儀檢測細胞表面標記表達率分別為CD34O．8％，CDl0613．6％，CD4499．7％，HLA-l96．7％，符合ADSC
5、s的表型特征。結論：所采用的細胞分離培養(yǎng)方法簡便可行，所獲得的ADSCs純度較高，細胞活力旺盛，自我更新能力強。第二部分：大鼠ADSCs向神經細胞的二步法誘導分化目的：探索以“ADSCs一神經(干細胞)球(第一步)一神經組織細胞(第二步)"的二步法誘導大鼠ADSCs向神經細胞定向分化的方法。方法：取第五代培養(yǎng)細胞進行誘導分化：無血清Neurobasal培養(yǎng)基聯(lián)合應用堿性成纖維生長因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)20ng／ml、表皮生長因子(epithelialgrowthfactor，EGF)20ng／ml和N2(1：100)添加劑，將細胞先誘導成
6、神經球，當形成的神經球達到15"--20個／低倍視野時，機械法輕柔吹打神經球使之離散，再以Neurobasal培養(yǎng)基重懸細胞，按13比例進行傳代。取第二代神經球加入l％胎牛血清、5％馬血清、O．5lamol／L的維甲酸(retinoieacid，Ⅱ碩士學位論文RA)和50ng／mL(brain．derivedneurotrophicfactor，BDNF)，促進其向神經元和膠質細胞方向分化。免疫細胞化學檢測巢蛋白(Nestin)、微管聯(lián)合蛋白2(MAP2)、B一神經微管蛋白(13．tubulinlII)、神經膠質纖維酸性蛋白(gliafibrillaryacidicprotein，GFA
7、P)及半乳糖苷酶(Galactocerebroside，OalC)等標志性蛋白的表達情況。熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、拍照記錄，并進行陽性細胞記數(shù)，掃描電鏡下觀察分化細胞的表面形貌。結果：傳代純化后的ADSCs貼壁生長，呈梭形，增殖旺盛，幾乎不表達NSCs標志性蛋白Nestin。無血清Neurobasal培養(yǎng)基誘導第3--．4天時，細胞開始向中央聚集，形成多個克隆團，第5---7天時，可見許多小的懸浮的神經球出現(xiàn)。神經球迅速增殖，14
