nesfatin-1對(duì)多巴胺神經(jīng)元的保護(hù)作用及機(jī)制探討

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1、Nesfatin．1對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用及機(jī)制探討摘要帕金森病(Parkinson’Sdisease，PD)是多發(fā)于中老年的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理改變是中腦黑質(zhì)(substantianigra，SN)致密帶多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元退行性變，從而導(dǎo)致紋狀體(striatum，Str)釋放的DA減少所致。雖然遺傳、環(huán)境、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、蛋白質(zhì)異常聚集等因素均參與PD的發(fā)病，但其確切病因尚不清楚。目前PD病人DA能神經(jīng)元的保護(hù)性治療途徑主要包括鐵離子去除途徑、單胺氧化酶一B抑制途徑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子補(bǔ)充、抗氧化劑的

2、應(yīng)用、神經(jīng)移植、神經(jīng)節(jié)苷脂途徑等，但尚無(wú)行之有效的治療辦法可以阻止或者延緩DA能神經(jīng)元的退行性變。因此，深入探討PD的發(fā)病機(jī)制，針對(duì)PD病因篩選研發(fā)更有效的天然或人工合成藥物成為PD研究的關(guān)鍵問(wèn)題之～。Nesfatin．1是2006年發(fā)現(xiàn)的一種由82個(gè)氨基酸組成的腦腸肽，由胃底的X／A樣細(xì)胞分泌，其主要功能是抑制攝食和參與能量代謝，新近研究發(fā)現(xiàn)它也可以參與調(diào)節(jié)生殖、應(yīng)激反應(yīng)、認(rèn)知等過(guò)程，并與抑郁和焦慮、癲癇的發(fā)病有關(guān)。目前有研究發(fā)現(xiàn)nesfatin．1在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血和腦外傷中通過(guò)抗凋亡機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。由于其與腦腸肽ghrelin都由胃

3、底的X／A樣細(xì)胞分泌，本課題組的前期研究工作已證實(shí)ghrelin對(duì)DA能神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)作用，那么，nesfatin-1對(duì)DA能神經(jīng)元是否具有同樣的保護(hù)作用?為了探討這一問(wèn)題，在l一甲基一4-苯基-1，2，3，6．四氫吡啶(1-methyl．4．phcnyl一1，2,3，6．tetrahydropyridin，MPTP)制備的亞急性PD／

4、、鼠模型上，通過(guò)高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography，HPLC)檢測(cè)了DA及其代謝產(chǎn)物的含量，免疫組織化學(xué)和免疫熒光技術(shù)觀察了DA能神經(jīng)元及其神經(jīng)末梢的改變，蛋

5、白免疫印跡法檢測(cè)了SN區(qū)酪氨酸羥化酶(tyrosinehydroxylase．TH)含量的改變，觀察了nesfatin-1對(duì)DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用。并進(jìn)一步在體外培養(yǎng)的DA能細(xì)胞系——MES23．5細(xì)胞上，應(yīng)用l一甲基-4一苯基吡啶陽(yáng)離子(1-methyl．4-phenylpyridilliumion，MPP+)制備PD的細(xì)胞模型，通過(guò)3一(4，5．二甲基噻唑．2)一2，5．二苯基四氮唑溴鹽(3一(4，5)一dimethylthiahiazo(-z．y1)．3，5．di．phenytetrazoliumromide，MTT)法檢測(cè)細(xì)胞存活率，流式

6、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體跨膜電位差(mitochondrialtransmembranepotential，AWM)和caspase一3活性的變化，werstemblot法檢測(cè)細(xì)胞色素C(cytochromeC，CytC)含量及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，ERKl／2)磷酸化的變化，細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變，來(lái)深入探討nesfatin—l神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。結(jié)果如下：1．在MPTP制備的亞急性PD模型小鼠中，Strl勾DA及其代謝產(chǎn)物二羥基苯乙酸(dihydroxyphenylac

7、eticacid，DOPAC)和高香草酸(homovanillicacid，HVA)的含量均降低，分別降低96．61％、85．51％和97．2％(P

8、時(shí)S仃區(qū)TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)纖維末梢減少。100ng／IxL，200ng／pL，400ng／I．tLnesfatin．1預(yù)處理可拮抗MPTP造成的DA能神經(jīng)元損傷，TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目分別恢復(fù)至正常對(duì)照組的100％，82％，80％(P<0．05)，TH蛋白表達(dá)分別恢復(fù)至正常對(duì)照組的100％，98％，95％(P

9、1(10。7～10‘13mol／L)預(yù)孵育后，可拮抗MPP+引起的細(xì)胞存活率的降低，分別為對(duì)照組的101．54％、114．39％、120