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1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文多重耐藥大腸埃希菌質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因研究姓名：尚忠波申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：陳秀樞2012-05-19溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文多重耐藥大腸埃希菌質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因研究中文摘要目的：1、以臨床分離多重耐藥大腸埃希菌(Escherichiacoli，Ecoli)為研究對(duì)象，對(duì)質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥機(jī)制(plasmid．mediatedquinolonesresistance，PMQR)進(jìn)行研究。2、對(duì)臨床分離的多重耐藥E．coli中喹諾酮外排泵基因q
2、epA的攜帶率、接合傳遞效率、基因功能等進(jìn)行研究。方法：1、以2004年1月～2008年12月間臨床分離的136株多重耐藥大腸埃希菌為研究對(duì)象，采用VITEK．GNS藥敏卡測(cè)定136株多重耐藥大腸埃希菌對(duì)14種抗菌素的敏感性；PCR法篩檢136株多重耐藥大腸埃希菌PMQR基因：qnr基因，包括qnrA、-B、-S、～C和~D，qepA基因以及氨基糖苷類乙酰轉(zhuǎn)移酶基因aac一陋')-Ib。aac一何")-Ib陽性PCR產(chǎn)物回收純化后經(jīng)FokI酶切，確定aac(6")-Ib—Cr。對(duì)qepA陽性菌株作16
3、SrRNA甲基化酶基因rmtB的檢測(cè)。PMQR陽性菌株進(jìn)行接合傳遞實(shí)驗(yàn)，接合子的耐藥基因經(jīng)PCR鑒定確認(rèn)。2、以初篩qepA陽性菌為研究對(duì)象，提取qepA基因陽性菌株及其接合子質(zhì)粒，繪制質(zhì)粒圖譜。瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)qepA接合子的MIC。以一株qepA基因陽性菌株為模板，擴(kuò)增qepA全長，與pET-12a質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化入E．coliBLl2宿主菌，研究qepA功能。結(jié)果：1、136株多重耐藥大腸埃希菌中共檢出72株攜帶PMQR基因，其中，54株為攜帶單基因者，18株為兩種或兩種以上基因同時(shí)存在，
4、PMQR基因的總陽性率為52．9％(72／136)。在32株(23．5％)qnr基因陽性株中，檢出的陽性基因數(shù)分別為qnrB14(10．3％)，qnrA13(9．56％)，qnrS12(8．82％)，未檢出qnrC和qnrD；而aac(6’J勘一cr的檢出率高達(dá)30．1％(41／136)，還檢出qepA19株(14．O％)。在19株qepA陽性菌中，有16株攜帶rmtB基因，二者的共存率高達(dá)84．2％。另外，通過接合傳遞實(shí)驗(yàn)，成功接合qnrA5株，qnrB8株，qnrS2株，qepA12株，aac簡(jiǎn)，
5、．／b—c，15株，未獲取同時(shí)含有兩種或兩種以上PMQR耐藥基因的接合子。2溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文2、質(zhì)粒圖譜繪制發(fā)現(xiàn)，供體菌和接合子質(zhì)粒均含有約23kb的質(zhì)粒。與E．coliBL21(pET-12a)相比，諾氟沙星、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星對(duì)E．coliBL21(pET-12a．qepA)的MIC分別升高64倍、32倍和4倍；而與羰基氰氯苯腙(carbonylcyanidem—chlorophenylhydrazone，CCCP)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)三種藥物的MIC值則至少降低為原值的1／4。進(jìn)一步檢測(cè)菌體內(nèi)環(huán)丙
6、沙星含量，在不含CCCP時(shí)，E．coliBL21(pET-12a．qepA)菌體中環(huán)丙沙星低于E．coliBL21(pET-12a)或E．coliBL21(P<0．01)：加入CCCP后，菌體內(nèi)環(huán)丙沙星含量明顯升高(尺O．01)o結(jié)論：本組多重耐藥大腸埃希菌中PMQR總陽性率為52．9％(72／136)，其主要耐藥基因的分布依次為aac佑，J舶．Cl"(30．1％)、qnr(23．5％)和qepA(14．0％)。接合傳遞實(shí)驗(yàn)顯示PMQR陽性株的一次接合成功率高達(dá)58．3％(42／72)，未獲取同時(shí)含有
7、兩種或兩種以上PMQR耐藥基因的接合子，提示其在細(xì)菌問水平傳播的概率高，還初步表明，PMQR在菌際間的傳播以單基因水平傳播為主要方式。另外，qepA陽性株伴隨rmtB共存率高達(dá)84．2％，并且19株qepA陽性菌獲得的12株接合子中rmtB基因陽性者9株，占75％，表明qepA基因和rmtB基因具有較密切的相關(guān)性和共存率，且容易在菌際間共同傳播；結(jié)合aac(6，勘一cr基因30．1％的檢出率，表明喹諾酮類PMQR與氨基糖苷類耐藥機(jī)制具有高度的相關(guān)性。對(duì)pET-12a-qepA重組E．coli的相關(guān)研究
8、表明，諾氟沙星、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星對(duì)E．coliBL21(pET-12a-qepA)的MIC較E．coliBL21(pET-12a)升高了4～64倍，而上述藥物與CCCP聯(lián)合應(yīng)用后，對(duì)E．coliBL21(pET-12a-qepA)的MIC至少降低為原值的1／4。qepA可編碼依賴質(zhì)子泵的外排蛋白，降低藥物在細(xì)菌體內(nèi)的含量，從而使細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性下降。關(guān)鍵詞：大腸埃希菌；多重耐藥；質(zhì)粒；喹諾酮；qepA溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文TheStudyonthe
