廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期差異蛋白表達(dá)的研究

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1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期差異蛋白表達(dá)的研究姓名：宋增梅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：潘長(zhǎng)旺；黃慧聰2012-05-22溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期蛋白差異表達(dá)的研究中文摘要廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)病(angiostrongyliasiscantonensis)，是由廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)(Angiostrongyluscantonensis)幼蟲(chóng)侵害人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的，是一種人獸共患寄生蟲(chóng)病。寄生蟲(chóng)需要通過(guò)改變宿主來(lái)完成其生活史，因此，他們有根據(jù)宿主環(huán)境來(lái)調(diào)節(jié)基因的差異表達(dá)的能力。廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)生活史的完成需要幾個(gè)不同的宿主。成蟲(chóng)寄生在正常

2、宿主大鼠體內(nèi)，大鼠可排出I期幼蟲(chóng)，I期幼蟲(chóng)經(jīng)水進(jìn)入中間宿主如福壽螺等軟體動(dòng)物體內(nèi)，并發(fā)育成為Ⅲ期幼蟲(chóng)；Ill期幼蟲(chóng)感染大鼠后，穿過(guò)血腦屏障發(fā)展成Ⅳ、V期幼蟲(chóng)，再移行至心、肺部血管內(nèi)發(fā)育成成蟲(chóng)。蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和相互作用以及基礎(chǔ)生物學(xué)的典范，可以從整體層次上，更精確、貼切地反映蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。而線(xiàn)蟲(chóng)是最好的研究模式生物之一。差異蛋白質(zhì)組學(xué)主要用于篩選和鑒定不同種類(lèi)和狀態(tài)下各樣本蛋白質(zhì)組之間的區(qū)別和變化，尋找任何能引起樣本間差異蛋白質(zhì)譜的有意義的因素，從而能進(jìn)一步認(rèn)識(shí)個(gè)體生理的發(fā)展與變化。雙向熒光差異凝膠電泳相對(duì)于傳統(tǒng)的雙向電泳能夠避免膠與膠之間的變異并提高

3、敏感性，在發(fā)育生物學(xué)和組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究中更顯其優(yōu)勢(shì)。本研究運(yùn)用雙向熒光差異凝膠電泳和質(zhì)譜相結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析鑒定廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。目的1．應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向熒光差異凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)ⅡI期幼蟲(chóng)、V期雌雄蟲(chóng)和雌雄成蟲(chóng)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。2．建立一個(gè)穩(wěn)定的廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期蛋白質(zhì)組的雙向熒光差異凝膠電泳圖譜，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析和鑒定，建立一個(gè)可靠的蛋白質(zhì)組學(xué)生物技術(shù)。3．探討可能與廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)，可以為宿主環(huán)境在寄生蟲(chóng)發(fā)

4、育過(guò)程中的調(diào)控或宿主一寄生蟲(chóng)相互作用中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)提供依據(jù)。方法1．廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)體的收集：實(shí)驗(yàn)室條件下建立廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)生活史，分別于感染的不同時(shí)期收集廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)ⅡI期幼蟲(chóng)、V期雌蟲(chóng)、V期雄蟲(chóng)、雌成蟲(chóng)溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文和雄成蟲(chóng)，蟲(chóng)體用0．01mol／LPBS緩沖液洗滌3次后，-80。C凍存。2．蛋白樣品的制備：將收集的蟲(chóng)體分別使用裂解液裂解、超聲裂解、離心，獲得的上清，使用Bio．Radproteinassayreagent測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。分裝后-80。C低溫保存。3．CyDye染料標(biāo)記蛋白質(zhì)：分別用Cy3或Cy5標(biāo)記樣品，Cy2標(biāo)記內(nèi)標(biāo)。4．雙向熒光差異凝膠電泳(2D．

5、DIGE)4．1第一向等電聚焦(IEF)4．2膠條的平衡4．3第二向SDS．PAGE電泳：12．5％的SDS．PAGE凝膠5．雙向熒光凝膠電泳的圖像掃描：利用U]VIaxPowerlook2110XL和TyphoonFLA9000對(duì)電泳后的膠板圖像掃描，得到不同顏色的掃描圖。6．DeCyder7．0圖像分析7．質(zhì)譜鑒定：膠內(nèi)酶解，抽提酶解肽段，ZipTip脫鹽，MALDI．TOF．MS鑒定、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果1．對(duì)廣州管圓線(xiàn)蟲(chóng)5個(gè)樣品及內(nèi)標(biāo)進(jìn)行雙向熒光差異凝膠電泳后，得到了清晰的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。用UMaxPowerlook2110XL和TyphoonFLA9000激光掃描儀于熒光模式

6、下進(jìn)行Cy2、Cy3、Cy5激光掃描，8塊張膠共得到24張熒光掃描圖譜。2．經(jīng)過(guò)DeCyder7．0軟件分析，校準(zhǔn)后，蛋白表達(dá)差異值經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(f檢驗(yàn))，篩選出在24張圖譜中均出現(xiàn)的點(diǎn)共183個(gè)蛋白點(diǎn)。與成蟲(chóng)相比，314、537、698、925和980這5個(gè)蛋白點(diǎn)在V期幼蟲(chóng)中表達(dá)上調(diào)，但沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的性別差異；與IⅡ期幼蟲(chóng)相比，點(diǎn)469、488、609、855、859、885、1253、1520和1416等89個(gè)蛋白點(diǎn)在成蟲(chóng)和V期幼蟲(chóng)中上調(diào)，相反的，點(diǎn)623、730、1053、1161和1060等13個(gè)蛋白點(diǎn)在IⅡ期幼蟲(chóng)中出現(xiàn)明顯上調(diào)；雌雄蟲(chóng)及V期幼蟲(chóng)雌雄比較中，點(diǎn)1496

7、在雄蟲(chóng)和V期幼蟲(chóng)雄蟲(chóng)中均表達(dá)上調(diào)。3．質(zhì)譜分析差異蛋白點(diǎn)，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒定了其中37個(gè)蛋白質(zhì)。10．81％是細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，如肌動(dòng)蛋白和副肌球蛋白；64．86％功能蛋白與代謝過(guò)程、免疫反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)，如熱休克蛋白和變換域相關(guān)蛋白；24．32％是未知的蛋白質(zhì)。這些差異表達(dá)蛋白在細(xì)胞黏附、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、蛋白質(zhì)水解、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等許多生理和病理過(guò)程。4．與V期雌蟲(chóng)相比，過(guò)氧化物氧還蛋白(1253)、吲哚胺2，3雙加氧酶(1520)和TRRAP．1ik