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1、大鼠肝微粒體細胞色素P450酶活性研究方法概括陳煥文（上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院藥劑科201203）【摘要】目的：綜述大鼠肝微粒體中細胞色素CYP450活性研究方法。方法：查閱國內外文獻，對肝微粒體CYP450進行介紹，并總結和歸納中藥在CYP450酶活性研究方法的應用。結果：CYP450研究方法主要包括體外實驗：CO吹泡法，化學顯色法，體外溫孵和體內cocktail探針實驗。該方法的應用從中藥單體成分逐漸發(fā)展到中藥提取物、中藥復方。結論：隨著科研水平的提高，體外方法對CYP450研究越來越深入，合體內cocktail探針
2、法，提高藥物體內代謝清除預測的準確性?！娟P鍵詞】中藥P450酶肝微粒體溫孵cocktail探針中藥，具多成分的特點，每一味中藥均含有大量的化學成分，在中醫(yī)藥理論指導下，遵循整體辯證論治的原則進行研究及治療。近十幾年來，中藥在細胞色素P450方面的應用越來越廣泛和深入，不僅僅局限于單體對P450酶活性的影響，后還有單味藥作為研究對象，發(fā)展到現(xiàn)在，中藥復方對P450酶的研究越來越受到海內外學者的關注。體現(xiàn)了中藥不僅局限于傳統(tǒng)的應用技術上，還不斷的融合于新技術、新思維、及新的領域，為更進一步的了解中藥多成分，多靶點，多效應
3、的理論基礎開創(chuàng)新的依據(jù)。一、細胞色素P450酶的簡介細胞色素P450酶是肝微粒體混合功能氧化酶中最重要的一族，在外源性和內源性的物質代謝中起著極其重要的作用，并引起自身或其他藥動學的改變,使得藥效增強或減弱，而導致藥物中毒或無效，藥物?藥物相互作用的結果，藥物對P450酶系活性的影響是藥物代謝相互作用最重要的機制。藥物代謝酶分I相和II相，細胞色素P450酶（以下簡稱CYP450或P450）是1相催化多種藥物、前毒物、前致癌物等外源性物質的氧化和還原代謝的主要酶類，細胞色素P450是由多種同功酶組成的超大“家族”，與
4、外源性化合物代謝作用有關的約30多種，主要由CYP1、CYP2和CYP3三個族組成，其中CYP1A2,CYP2C9/CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1和CYP3A4是最主要的6種亞型，含量約占肝內CYP450酶總量的80%以上且90%以上的上市藥物是由這6種亞型代謝的［1-3］o表1闡述了在肝臟中CYP亞型酶個體的相對比例，列舉包括底物、抑制劑和誘導劑。眾所周知，CYP亞型酶能代謝大多數(shù)在結構上有差異的外源性物質，還有很多綜述均作了詳細的報道［4?刀。表1肝臟中各CYP450亞型的相對含量百分比，探針底物，抑
5、制劑及誘導劑二、P450酶活性方法研究查閱近十年來國內外文獻，考察中藥對P450酶活性的方法大致歸為2類：體外和體內研究方法。2.1體外研究方法肝藥代謝酶檢測方法中最常用的是肝微粒體法，此法制備簡單，代謝時間短，易于重現(xiàn)，方便犬量操作。檢測肝微粒體P450酶活性的體外研究方法,大致歸為3類：CO吹泡法，化學比色法，體外溫孵法。無論采用哪種方法，測蛋白含量是基礎和必需的，目前常用測蛋白含量的方法有微量凱氏定氮法，Lowry法⑻及考馬斯亮藍染色法⑼。2.1.1CO吹泡法［10］基本原理：在還原狀態(tài)下的細胞色素P450可與
6、一氧化碳結合，形成復合物，在波長450nm處出現(xiàn)最大吸收峰，根據(jù)峰高測定值的大小計算P450酶的含量。將待測藥物對大鼠灌胃數(shù)日，后取其肝臟制備肝微粒體，測定蛋白濃度及P450酶含量。該方法是測定P450酶含量最經典的方法，國內大部分學者均是通過測藥物對P450酶含量的影響來反映酶活性，因為P450酶活性及其催化能力由酶含量決定，而U此種測酶活性的方法操作簡便，指標明確，檢測手段多為紫外分光光度儀，條件易滿足。如：趙潤英等［11］,研究肉豆蔻揮發(fā)油對肝臟微粒體細胞色素P450(CYP)、細胞色素B5(Cytb5)、丙二
7、醛(MDA)和血清谷胱甘肽轉移酶(GST)的含量；胡錫琴，林飛等［12］研究何首烏、制何首烏以及分別配伍不同劑量茯苓對大鼠肝臟微粒體細胞色素P450酶(CYP450)的影響;韋炳華，宗連柱等［13］研究復方丹參滴丸對大鼠肝微粒體細胞色素P450含量的影響；Kishida,T.;Ataki,H.等［14］研究曲霉發(fā)酵過的黃豆粉對大鼠肝微粒體P450酶含量的影響。同樣的測酶含量變化來反映酶活性的有葛根素，枳覆子乙酸乙酯提取物，人黃蔥醍衍生物，人參、藜蘆^［15-18］；由此可知，測酶含量的方法不僅適用于單體，提取物，同吋
8、對復方的應用亦逐漸嘗試，由于酶含量測量指標與藥物的成分復雜程度并無直接關系，但不能直接反映藥物對具體的亞型酶的活性影響，而僅僅是總P450酶的活性。2.1.2化學比色法基本原理：二甲基亞硝胺主要經細胞色素P4502E1的催化，先進行碳位的甕化，繼而甲醇胺中間產物分解，釋放出甲醛，通過Nash比色法以測定甲醛生產量的多少來反應P4502E1的活性
