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《比格犬β--防御素cbd127基因的克隆及表達》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、萬方數(shù)據(jù)CloningandExpressionofp-defensinGeneCBD127ofBeagleThesissubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomy——FengPei—xiang(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supervisor：YinYan-boQingdao．ChinaJune，2014萬方數(shù)據(jù)本
2、研究由“十二五’’農(nóng)村領(lǐng)域國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863)項目(項目編號：2012從101303)提供資助萬方數(shù)據(jù)獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得青島農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均己在論文中作了明確的說明并表示了謝意。啾躲7易么吩帆伽修加諂關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解青島農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定
3、，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意青島農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。研究生簽名：導(dǎo)師簽名：時間：勁五夠年多月彳日時間：砂眥年多月v／犯萬方數(shù)據(jù)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要比格犬p．防御素CBDl27基因的克隆及表達摘要本實驗運用分子生物學(xué)技術(shù)，從比格犬睪丸組織中克隆出CBDl27eDNA片段，并構(gòu)建pMDl9．T-CBDl27克隆載體和pGEX．6p．1．CBDl27表達質(zhì)粒，對表達融合蛋白的生物學(xué)活
4、性進行了初步研究。1．登陸GenBank，參考犬D．防御素基因CBD127序列(DQ011996．1)，設(shè)計1對引物來擴增比格犬p防御素CBDl27基因，提取比格犬睪丸組織總RNA，利用RT-PCR擴增得到CBDl27基因eDNA全長序列303bp。對．PCR產(chǎn)物進行純化回收，構(gòu)建pMDi9．T-CBDl27克隆載體。設(shè)計帶酶切位點引物擴增并純化CBDl27基因與空載體pGEX．6p一1利用EcoRI／XhoI雙酶切純化后，16℃條件下經(jīng)T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5a，涂布Amp／LB平板，挑取陽性茵落測序，將測
5、序準確的茵液抽提質(zhì)粒，進行PCR和酶切鑒定，將其命名為pGEX．6p．I．CBDl27。2．將重組質(zhì)粒pGEX．6p．1．CBDl27轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中，進行IPTG誘導(dǎo)和蛋白的純化。經(jīng)SDS．PAGE檢測，獲得了約36ku的目的蛋白。Western-blot分析表明，重組蛋白獲得了表達。微量瓊脂平板擴散法檢測表達產(chǎn)物體外生物活性，結(jié)果顯示表達的CBDl27蛋白對金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸桿菌(ATCC25922)、糞腸球菌(A=rCC29212)、酵母菌GSll5、白色念珠球菌(ATCC1023
6、1)、沙門氏茵都能有一定的抑菌活性，測得的MIC分別為25．00mg／L、50．00mg／L、25．00mg／L、50．00mg／L、50．oomg／L。對綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌則無抑茵活性。CBDl27融合蛋白經(jīng)不同溫度和酸堿度處理后作用金黃色葡萄球菌，仍有抑茵活性，顯示該融合蛋白對溫度和酸堿度有一定的穩(wěn)定性。體外CDV病毒感染Vero細胞后，加入CBDl27融合蛋白處理后，觀察后測定TCID50，結(jié)果提示，CBDl27融合蛋白對有囊膜的CDV沒有抑制作用。綜上所述，本研究成功從比格犬睪丸組織克隆出CBDl27目的片段，構(gòu)建
7、了表達載體pGEX．6p-l—CBDl27，IPTG誘導(dǎo)并純化出目的蛋白，并初步探討了純化蛋白的活性及其理化特性。本論文為防御素在畜牧業(yè)上的應(yīng)用與開發(fā)提供了一定的研究基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：比格犬：
8、B一防御素：克隆：蛋白袁達：抑菌活性：抗病毒活性萬方數(shù)據(jù)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文AbstractCloningandExpressionofp—DefensinGeneCBDl27ofBeagleAbstractUsingmolecularbiologytechniques，WeamplifiedCBDI27eDNAfragmentfrom
9、beagledog’Stesticulartissue，andinsertedthegeneintovector,andfinallybuiltpMDl9-T-CBDl27cloningvectorandpGEX一61>1一CBDI27expressionplasmid．Th
