資源描述：
《鱖魚泛素連接酶基因的克隆、表達及功能研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、中山大學碩士學位論文鱖魚泛素連接酶基因的克隆、表達及功能研究姓名：張慧申請學位級別：碩士專業(yè)：水生生物學指導教師：何建國20070609張慧中山大學碩士學位論文鱖魚泛素連接酶基因的克隆、表達及功能研究專業(yè)：水生生物學碩士生：張慧導師：何建國教授中文摘要鱖魚(SinlpercaChuatsi)是我國重要的養(yǎng)殖品種，而近年來傳染性脾腎壞死病毒(infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)對鱖魚養(yǎng)殖造成了嚴重的經(jīng)濟損失．為了研究病毒與宿主的相互作用，在ISKNV感染鱖魚的抑制性消減雜交eDNA文庫基礎(chǔ)上，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析后發(fā)現(xiàn)有一個與泛
2、素連接酶E3基因序列比較相似的EST(expressedsequencetag,EST)．泛素連接酶E3是uPP(ubiquitinproteasomepathway)途徑中一種重要酶，對底物蛋白的特異性識別起重要作用。根據(jù)以上EST，通過eDNA末端快速擴增技術(shù)成功獲取了鱖魚E3基因的eDNA全長。該基因eDNA全長3833bp。有一個330bp的5，非翻譯區(qū)(5'-UTR)和一個932bp的3’非翻譯區(qū)(3'-UTR)，在3’非翻譯區(qū)有一個很典型的加尾信號(AATAAA)．E3全長eDNA含一個長達2571bp的開放閱讀框(openreadingframe，ORF)，編碼856個
3、氨基酸的蛋白質(zhì)，經(jīng)生物信息學分析，預測該蛋白分子量為98195．52Daltous，等電點為5．054。比對發(fā)現(xiàn)該蛋白為一種E6-AP的泛素連接酶，在其C端有一個保守的約350個氨基酸的HECT(HomologoustotheE6-APCarboxylTerminus)結(jié)構(gòu)域。實時熒光定量PCR檢測組織分布的結(jié)果顯示。該E3基因幾乎在各個組織中都有分布．其中，血細胞中的含量最高，而腮中最張慧中山大學碩士學位論文少。進行了鱖魚E3的大腸桿菌原核表達。以pGEX-4T-1原核表達載體成功構(gòu)建了pGEX-E3質(zhì)粒并分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)后獲得了目的蛋白的高效表達，且表達蛋白可溶性良好。
4、．蛋白印跡實驗證實了正確表達了目的蛋白．為了進一出研究該基因的功能，采用經(jīng)典的體外泛素化實驗，驗證該E3泛素連接酶的活性．采用UbcH2，UbcH3，UbcH5a,UbcH5c,UbcH7，UbcH9,UbcHl0，UbcHl2,E2．MFC鱖魚E2)8種不同類型的泛素聚合酶E2與該E3進行體外泛素化實驗，發(fā)現(xiàn)其可以與UbcH5a以及UbcH7協(xié)作完成體外泛素化；另外還跟鱖魚的自身的泛素聚合酶E2作用，并且兩者之問體外泛素化作用最強．這些結(jié)果表明該蛋白具有E3泛素連接酶活性。本文首次從鱖魚中獲得E3全長eDNA序列，并證明了其泛素連接酶活性。uPP途徑是生命活動過程中重要的蛋白代謝途
5、徑之一，因此，本文為uPP途徑在鱖魚體內(nèi)生理作用的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)，同時也為進一步研究鱖魚與病毒侵染過程中uPP途徑的作用開拓了方向，對于研究ISKNV與宿主問的相互作用具有重要的意義。關(guān)鍵詞：鱖魚，泛素連接酶，體外泛素化Ⅱ張慧中山大學碩士學位論文Molecularcloning，expressionandfunctionalreasearhofubiquitinligaseE3frommandarinfish，SinipercaChuatsiMajor：HydrobiologyMastercandidate：ZhangHlliSupervisor：ProfessorHeJian
6、guo，Ph．DInthelastdecade,sig
7、1iljcameconomiclossesinculturedmandarinfish，Sinipercachuatsi，havebeenattn'butedtooutbreaksofinfectiousspleenandkidneyneurosisvirus(IsⅪqv)．Inordertostudytheinteractionbetweenthevirusandthehost,suppressionsubtractivecDNAhnorarieswere：constructedfromspleensofmock-andISK
8、NVinfectedmandarinfishinourlab．AcomplementaryDNA(cDNA)fragmentwithsequencesimilartoubiquitinligaseE3，aproteinthathasakeyfunctioninrecognizingthesubstratesinuPP(ubiquitinproteasomepathway)．wasthenchosenfromthislibraryforfurtherstud
