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《hbx蛋白通過調(diào)控原代小鼠肝細(xì)胞周期促進(jìn)hbv復(fù)制的分子機(jī)制研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、重慶醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文HBx蛋白通過調(diào)控原代小鼠肝細(xì)胞周期促進(jìn)HBV復(fù)制的分子機(jī)制研究姓名：羅娜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：吳小翎201205重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文I-t-Bx蛋白通過調(diào)控原代小鼠肝細(xì)胞周期促進(jìn)HBV復(fù)制的分子機(jī)制研究摘要背景和目的：乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，I-IBV)編碼的HBx蛋白是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，它與HBV復(fù)制水平和HBV相關(guān)性原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，但其具體調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。目前研究發(fā)現(xiàn)在永生化和轉(zhuǎn)
2、化細(xì)胞系中，有效的HBV復(fù)制依賴于HBx蛋白，其中HBx蛋白的羧基端具有關(guān)鍵作用。但在正常肝細(xì)胞中，HBx通過何種途徑調(diào)控HBV的復(fù)制、如何影響細(xì)胞增殖途徑以及其作用的確切功能區(qū)尚不清楚。本課題以正常原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞為研究對(duì)象，探討HBx蛋白及其截短體對(duì)細(xì)胞周期和HBV復(fù)制水平的影響及其相互關(guān)系，并確認(rèn)HBx發(fā)揮上述作用的主要功能區(qū)，以揭示HBx蛋白參與調(diào)控細(xì)胞周期和HBV復(fù)制的分子機(jī)制。方法：(1)運(yùn)用改良的原位兩步膠原酶灌流法對(duì)C57BL／6小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行分離純化，采用含多種添加物的無血清WME培養(yǎng)基對(duì)小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，過碘酸雪夫氏
3、(Periodicacid．Schiff's，PAS)染色、生化法鑒定肝細(xì)胞的功能和分化特性，免疫蛋白印跡(Westemblot)法本課題受國家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：30872249)和重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研計(jì)劃項(xiàng)目重點(diǎn)項(xiàng)目(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：2010-1-37)資助。3重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文檢測(cè)新鮮分離和原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的細(xì)胞周期標(biāo)志物p16、p21、cyclinD1、cyclinE、cyclinA的表達(dá)水平。(2)利用船x及其截短體表達(dá)質(zhì)粒pSI．HA．X、pSI．HA．X卜101、pSI．HA．X43。154，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞
4、，免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)／Westernblot法檢測(cè)HBx蛋白表達(dá)水平。Westemblot法檢測(cè)細(xì)胞上述周期標(biāo)志物表達(dá)水平。(3)利用編碼HBV全基因組1．2倍體(paywl．2)的pGEM-HBV質(zhì)粒和HBx缺失突變的相同質(zhì)粒pGEM-HBVAX瞬時(shí)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞，將pSI．HA．X、pSI．HA．X1砌1、pSI．HA．炙3。154分別與pGEM-HBVAX共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，IP／Westernblot法檢測(cè)HBx蛋白表達(dá)水平，Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞上述周期標(biāo)志物及HBV編碼蛋白HBc的表達(dá)
5、，Southem印跡雜交(Southernblot)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBV復(fù)制水平。(4)利用特異性沉默p53基因的miRNA干擾質(zhì)粒分別與pGEM-HBV和pGEM-HBVAX共轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞，IP／Westernblot法鑒定p53沉默效率，Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞上述周期標(biāo)志物及HBV編碼的HBc蛋白的表達(dá)，Southem印跡雜交(Southemblot)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HBV復(fù)制水平。結(jié)果：(1)原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞能保持合成白蛋白、尿素、糖原的肝臟特異性功能和分化特性，并能維持與新鮮分離肝細(xì)胞相同的靜
6、息細(xì)胞周期(GO期)狀態(tài)。4重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文(2)在轉(zhuǎn)染后原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞中IP／Westernblot法能檢測(cè)到全長HBx蛋白及其羧基端截短體HBxl。101、氨基端截短體HBx43以54的表達(dá)，全長HBx與硒X43J54的表達(dá)水平相當(dāng)，而HBx卜101的表達(dá)水平明顯低于前兩者。全長HBx與HBx43。54能下調(diào)p16的表達(dá)水平，上調(diào)p21、cyclinD、cyclinE的表達(dá)水平，對(duì)cyclinA的表達(dá)水平無影響，HBx卜101對(duì)上述細(xì)胞周期標(biāo)志物的表達(dá)水平均無影響。在增加pSI．HA．X卜101質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量以提高HBx卜10
7、1蛋白表達(dá)水平之后，對(duì)細(xì)胞周期標(biāo)志物的表達(dá)仍無影響。(3)與pGEM—HBVAX組細(xì)胞相比，pGEM-HBV組細(xì)胞內(nèi)p16的表達(dá)下調(diào)，p21、cyclinD、cyclinE的表達(dá)上調(diào)，cyclinA的表達(dá)水平無明顯變化，且核心顆粒HBVDNA水平明顯高于pGEM．HBVAX組細(xì)胞。分別以全長HBx和HBx43。154重建pGEM-HBVAX缺失的HBx蛋白表達(dá)之后，其各項(xiàng)細(xì)胞周期標(biāo)志物的表達(dá)和核心顆粒HBVDNA均能夠恢復(fù)到與pGEM．HBV組細(xì)胞相似的水平，但即使增加pSI．HA．X卜101質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量以使HBxl。101蛋白表達(dá)水平與全長HB
8、x和HBx43‘154相當(dāng)，pGEM-HBVAX組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期標(biāo)志物的水平和核心顆粒HBVDNA水平仍然沒有明顯改變。HBV編碼的HBc蛋白水平在各
