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《elp特性研究及elp標簽在重組蛋白純化中的應用》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、萬方數據Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterTheResearchonCharacteristicsofELPandtheELP-taggedSystemforProteinPurificationByJunYuanSupervisor：Prof．Ju’eZhangDepartmentofBiochemistryandMolecularBiologyBasicMedicalCollegeApril2014萬方數據學位論文原創(chuàng)
2、性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學位論文，是本人在導師的指導下，獨立進行研究所取得的成果。除文中已經注明引用的內容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均己在文中以明確方式標明。本聲明的法律責任由本人承擔。?姍：袁泰魄訓Ⅲ，日學位論文使用授權聲明本人在導師指導下完成的論文及相關的職務作品，知識產權歸屬鄭州大學。根據鄭州大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留或向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人授權鄭州大學可以將本學位論文的全部或
3、部分編入有關數據庫進行檢索，可以采用影印、縮印或者其他復制手段保存論文和匯編本學位論文。本人離校后發(fā)表、使用學位論文或與該學位論文直接相關的學術論文或成果時，第一署名單位仍然為鄭州大學。保密論文在解密后應遵守此規(guī)定。靴敝儲：移日期：ⅥI唯年6月1日萬方數據摘要EkP特性研究及ELP標簽在重組蛋白純化中的應用目的研究生：袁君導師：張菊娥教授鄭州大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室河南鄭州450001探討類彈性蛋白多肽(ELP)的可逆相變循環(huán)(ITC)特性，以及運用ELP作為標簽對In目的蛋白進行表達純化，觀察ELP融合蛋白的I
4、TC性質以及影響其可逆相變溫度的因素，以期獲得ELP在更多蛋白分離純化中的應用。方法1．ELP基因及其引物，目的基因In及ELP．In連接引物的合成，并以合成基因為模板進行擴增。2．ELP／pGEM—Teasy，ELP．In／pGEM．Teasy重組克隆載體的建立，將構建好的載體轉化至大腸桿菌DH50t感受態(tài)中，涂LA固體培養(yǎng)基平板，挑取單克隆至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，送去測序。3．將測序正確的單克隆菌液取少量用于提取質粒，進行雙酶切后膠回收目的片段，連接至表達載體pET28b中，構建重組表達載體ELP／pET28b和ELP．In
5、／pET28b，分別將其轉化至大腸桿菌DH50t感受態(tài)中進行擴增，然后提取質粒雙酶切驗證后，將質粒轉化至大腸桿菌BL2l(DE3)感受態(tài)中，涂LK固體培養(yǎng)萬方數據摘要基平板，挑取單克隆至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進而用IPTG誘導表達。4．利用WestemBlot技術分別檢測ELP／pET28b，ELP．In／pET28b是否表達及其表達形式。5．將純化的ELP．In／pET-28b蛋白用BCA法定量，稀釋成濃度為1．01．tM／I_tl，分別取600Irtl于1．5mlEP管中，置于5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，3
6、5℃和40"C水浴保溫15min，再分別取400肛1于比色杯中用分光光度計測OD350。相變溫度Tt即為OD350最大吸光度值一半時的溫度。6．ELP／pET28b，ELP-In／pET28b表達成功后，觀察(NH4)2S04濃度和pH對可逆相變溫度的影響，確定最合適的條件，用ITC性質分別對其進行純化，再過鎳柱后得到進一步純化。結果1．合成ELP，In模板和相關引物，并擴增出相應的目的基因。2．ELP／pGEM-Teasy，ELP．In／pGEM-Teasy重組克隆載體經菌液PCR跑瓊脂糖凝膠電泳有目的條帶后送去測序正確，說明
7、重組克隆載體構建成功。3．測序正確菌種提取質粒，分別雙酶切后連接表達載體pET28b轉入DH5a，菌液PCR跑瓊脂糖凝膠電泳有目的條帶，提取質粒轉入BL21(DE3)，菌液PCR鑒定有目的條帶，提示重組表達載體建立成功。4．分別誘導表達后經WesternBlot檢測后顯示ELP／pET28b，ELP．In／pET28b均在蛋白水平上有表達，且呈可溶性形式表達。5．經分光光度計檢測，檢測不到ELP／FIET28b的可逆相變溫度，而檢測到ELP．IrdpET28b的可逆相變溫度約為30℃。6．觀察(NH4)2S04濃度和pH對可逆相
8、變溫度的影響，根據影響因素，將ITC條件確定為(NH4)2s04為0．4M，pH6．0和Tt為25。C，ELP．1n／pET28b可得到初步純化，再利用pET28b上的His標簽過鎳柱后得到進一步純化。結論本實驗成功合成融合蛋白并誘導表達出可溶性形式表達的融合蛋
