基因打靶與體細(xì)胞克隆技術(shù)制備乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展

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1、中國畜牧獸醫(yī)2009年第36卷第4期生物技術(shù)·65·基因打靶與體細(xì)胞克隆技術(shù)制備乳腺生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展袁天杰，杜衛(wèi)華，郝海生，朱化彬(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)摘要：在動物乳腺生物反應(yīng)器研究中，傳統(tǒng)方法不可避免地造成基因表達(dá)調(diào)控元件的人工拼接和外源基因在動物基因組中隨機(jī)整合所帶來的“位置效應(yīng)”，致使轉(zhuǎn)基因動物外源基因的表達(dá)水平不高且差異較大。而基因打靶在外源基因定點(diǎn)整合、消除位點(diǎn)效應(yīng)方面具有明顯優(yōu)勢。體細(xì)胞核移植技術(shù)可以提前在細(xì)胞水平對轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行篩選，不但可以節(jié)省時間，更降低了

2、制備乳腺生物反應(yīng)器的成本。作者簡述了基因打靶與體細(xì)胞核移植技術(shù)結(jié)合制備乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)越性、存在問題、解決辦法及其應(yīng)用前景和展望。關(guān)鍵詞：基因打靶；核移植；轉(zhuǎn)基因動物；乳腺生物反應(yīng)器中圖分類號：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1671-7236(2009)04—0065—04早在1982年，Gorden等建立了第1例乳腺生是2O世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)重要的分子生物物反應(yīng)器小鼠模型，并首次報道在小鼠的乳汁中表學(xué)技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)的實(shí)質(zhì)是對特定的基因序列進(jìn)行達(dá)出人組織纖維酶原激活劑(tPA)。此后，乳腺生定點(diǎn)的

3、分子生物學(xué)改造。這些改造包括基因替換物反應(yīng)器作為藥用蛋白質(zhì)的全新生產(chǎn)模式，成為生(geneknoekin)用一段設(shè)計好的序列整合到或替物技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展的重要方向。乳腺生物反應(yīng)器具有換動物基因組的特定位點(diǎn)，即利用基因轉(zhuǎn)移方法，將能夠生產(chǎn)出完全生物活性的藥用蛋白，純化簡單，投外源DNA序列導(dǎo)入靶細(xì)胞后，通過外源DNA序列資少，成本低等優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)的藥用蛋白可以獲得巨額與靶細(xì)胞內(nèi)染色體上同源DNA序列間的重組，將經(jīng)濟(jì)效益。然而在制備轉(zhuǎn)基因動物過程中，外源基外源DNA定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組某一特定位點(diǎn)因在宿主動物體內(nèi)的表

4、達(dá)大多停留在一個較低水及基因剔除(geneknockout)對某一預(yù)先確定的平，且個體間表達(dá)水平差異很大。通過基因打靶，可靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而改變細(xì)胞遺傳特性以將目的基因定向地送到一個乳蛋白基因座或一個(Capecchi等，1989)。已知可以在乳腺組織高效表達(dá)外源基因的座位上，1．2基因打靶策略以達(dá)到高效表達(dá)的目的。體細(xì)胞克隆技術(shù)可以降低1．2．1ES細(xì)胞基因打靶基因打靶技術(shù)具有位點(diǎn)生產(chǎn)乳腺生物反應(yīng)器動物的成本，這將促進(jìn)這項(xiàng)技專一性強(qiáng)，打靶后目的片段可以與染色體DNA共術(shù)的產(chǎn)業(yè)化，于是許多學(xué)者開始利用基

5、因打靶技術(shù)同穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)。小鼠ES細(xì)胞能在體外培養(yǎng)并進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的定位整合研究，基因打靶與體細(xì)胞核保留發(fā)育的全能性；經(jīng)過體外基因打靶引入外源基移植技術(shù)結(jié)合將成為制備乳腺生物反應(yīng)器的發(fā)展因后，重新植回小鼠胚胎，可發(fā)育成生殖系攜帶精確趨勢。修飾突變的嵌合體小鼠。這兩個特性使基于小鼠胚1基因打靶制備乳腺生物反應(yīng)器胎干細(xì)胞(ES)的基因打靶技術(shù)成為一種常規(guī)技術(shù)1．1基因打靶的原理基因打靶(genetargeting)并得以廣泛應(yīng)用(Muller等，1999)。令人遺憾的是，盡管世界上眾多科學(xué)家做了很多努力，至今尚未收

6、稿日期：20081l17獲得家畜的ES細(xì)胞用于基因打靶，成為十幾年來作者簡介：袁天杰(1981一)，男，河北人，碩士，研究方向：胚胎基因打靶制備乳腺生物反應(yīng)器研究的限制性瓶頸工程。(Piedrahita等，2000)。通信作者：朱化彬(1965)，男，安徽人，碩導(dǎo)，研究員，從事胚胎1．2．2體細(xì)胞基因打靶制備乳腺生物反應(yīng)器在工程與繁殖生物技術(shù)研究。E—mail：huabinzhu@ya—體細(xì)胞克隆技術(shù)成功之前，科學(xué)家們主要將基因打hoo．corn．en靶技術(shù)與鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用，因?yàn)镋S基金項(xiàng)目：農(nóng)

7、業(yè)部奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)El(nycytx-lO)；跨越計劃項(xiàng)目“優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶?？焖俑咝Х庇夹g(shù)集成與產(chǎn)業(yè)細(xì)胞發(fā)生同源重組(homologousrecombination，化示范”；國家自然基金項(xiàng)目(30700584)。HR)的頻率高，而且只有ES細(xì)胞才能將這種打靶·66·生物技術(shù)中圍畜牧獸醫(yī)2009年第36卷第4期修飾遺傳到生殖系，從而獲得打靶的純合動物。代培養(yǎng)、基因打靶、藥物加壓、高通量篩選中靶細(xì)胞2000年7月，PPL公司的McCrearh等(2000)在到核移植需要傳代約45次(Clark等，2000)，

8、盡管Nature上報道C0L1A1(原膠原)基因在胎兒成纖傳代超過45次的牛成纖維細(xì)胞作為核供體，仍具有維細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行基因打靶，在(0L1A1基因內(nèi)插入了全能性，但衰老的細(xì)胞打靶效率降低。更重要的是，IRES和無啟動子的”D和a1一antitrypsin(AAT)一個細(xì)胞系能夠進(jìn)行基打靶的次數(shù)受到了限制，基因，用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生產(chǎn)克隆綿羊，使乳中AAT蛋很難進(jìn)行2次甚至更多次基因打靶。目前，尚未有白含量高