金定鴨fth1基因的克隆及功能初步鑒定

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1、金定鴨FTHl基因的克隆及功能初步鑒定MolecularCloningofFTH1geneanditsFunctionalAnalysisinJindingDuck研究生：童一宇專(zhuān)業(yè)：動(dòng)物遺傳育種與繁殖導(dǎo)師：陳國(guó)宏教授徐琪副教授本研究受現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)項(xiàng)(nvcytx．45．04)、國(guó)家自然科學(xué)基金(3101704)資助揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院2014年5月童一宇：鴨FTHl基因的克隆及功能初步鑒定金定鴨FTHl基因的克隆及功能初步鑒定中文摘要鐵蛋白是在真核生物中儲(chǔ)存鐵的可溶性組織蛋白，主要由兩種亞基構(gòu)成：重鏈蛋白與輕鏈蛋白。重鏈蛋白上含有亞鐵氧化酶

2、活性位點(diǎn)(ferroxidasecenter)，能參與鐵的吸收和釋放，是鐵蛋白的主要功能元件。重鏈蛋白由鐵蛋白重鏈多肽1(ferritinheavychainpolypeptidel，F(xiàn)THl)基因編碼，其基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上和轉(zhuǎn)錄后都有調(diào)控，而轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是由鐵調(diào)節(jié)蛋白介導(dǎo)的。鐵蛋白主要參與鐵的代謝和調(diào)節(jié)，而最新研究發(fā)現(xiàn)它也具有許多與鐵調(diào)節(jié)不相關(guān)的功能。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)鐵蛋白與疾病密切相關(guān)，例如肝炎、糖尿病、腫瘤、白血病等。也有報(bào)道表明鐵蛋白參與脊椎動(dòng)物的先天性免疫。本課題組通過(guò)抑制性消減雜交技術(shù)篩選雛鴨肝炎病毒侵染下的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)FTHl基因是鴨肝

3、炎病毒感染過(guò)程中的關(guān)鍵候選基因之一。本研究克隆了金定鴨FTHl基因編碼區(qū)(CDS區(qū))序列，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了FTHl在不同組織中的表達(dá)情況，并分析了感染雛鴨肝炎病毒(DHV-1)后FTHl基因和Caspase．3等凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的變化，旨在找出FTHl基因與DHV-1感染雛鴨的內(nèi)在聯(lián)系。為進(jìn)一步探究鴨中FTHl基因的功能，我們用基因工程和轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建并鑒定FTHl基因的過(guò)表達(dá)和RNA干擾載體，并用qRT-PCR檢測(cè)了FTHl的表達(dá)變化對(duì)Caspase．3等凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。研究旨在探究FTHl的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其在鴨病毒性肝炎中的作用，為研

4、究鴨FTHl基因與疾病的關(guān)系提供新的證據(jù)，也為抗病育種的研究提供新的基因資源。具體研究結(jié)果如下：1．通過(guò)RT-PCR及TA克隆技術(shù)獲得了FTHl基因的CDS區(qū)序列。其CDS序列全長(zhǎng)為546bp，共編碼181個(gè)氨基酸。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)THl在肝臟、脾臟等所檢測(cè)組織中都有表達(dá)，且在肝臟、脾臟和肺中表達(dá)量較高，在心臟和腎等組織中表達(dá)相對(duì)較低。2．qRT-PCR檢測(cè)了在雛鴨肝炎病毒(DI-IV-1)感染后，肝臟和脾臟中FTHl的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染組中FTHl基因的mRNA表達(dá)量都顯著下調(diào)(P

5、l表達(dá)。而對(duì)感染后肝臟和脾臟中Caspase．3等凋亡相關(guān)基因的表達(dá)分析則表明，凋亡抑制因子Bcl．2的表達(dá)顯著下調(diào)(氏0．05)，而凋亡促進(jìn)因子Caspase．3、Caspase．8的表達(dá)都顯著上調(diào)(P

6、-8的表達(dá)。而抑制FTHl表達(dá)后，則抑制了Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)了Caspase-3的表達(dá)。表明FTHl表達(dá)的變化可能會(huì)影響細(xì)胞凋亡。關(guān)鍵詞：金定鴨；FTHl基因；RNAi；qRT-PCR；細(xì)胞凋亡童一宇：鴨FTHl基因的克隆及功能初步鑒定MolecularCloningofFTHlanditsFunctionalAnalysisinJinDingDuckAbstract3一FerritinOCCURSasasolubleproteinwhichcanstoreironineukaryotic．Itiscomposedoftwosubunits：heavyc

7、hainandlightchain,encodedbytwodistinctgenes．Theheavychaincontainsaferroxidasecenterandisthoughttoberesponsiblefortherapiddetoxificationofiron．Itperformstheprimaryfunctionofferritin．Ferritinheavychain(FHC)isencodedbyferritinheavychainpolypeptideI(FTHl)gene，thegeneexpressionisregulat

8、edtranscriptionallyandpost