sybrgreenⅰ熒光定量rt-pcr檢測j亞群禽白血病病毒方法的建立及應(yīng)用

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1、摘要J亞群禽白血病((AvianLeukosisVirusSubgroupJ,ALV-J)是由J亞群禽白血病病毒引起的雞骨髓樣細(xì)胞瘤以及其它腫瘤性性疾病。1999年，我國首次由杜巖等在肉雞的商品代中分離了ALV-J。J亞群禽白血病在我國呈現(xiàn)了不斷發(fā)展的態(tài)勢,宿主范圍已從肉用型雞向蛋雞和地方雞種蔓延,病雞的生產(chǎn)性能降低，死亡率明顯升高,給我國養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立快速、特異和敏感的ALV-J檢測方法具有重要的實(shí)際意義。為建立SYBRGreenⅠ熒光定量PCR檢測ALV-J的方法，本研究

2、以ALV-J原型毒株HPRS-103基因組中pol基因3’端和gp85基因之間的保守區(qū)域作為檢測靶基因片段，構(gòu)建其重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，通過對模板濃度、引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，建立了ALV-JSYBRGreenⅠ熒光定量PCR方法。結(jié)果顯示該方法的最低3檢測限度為2.36×10DNA分子/μL，較普通PCR提高100倍；可特異性擴(kuò)增出545bp的ALV-J目的基因，而對其他禽源病毒無交叉反應(yīng)；批內(nèi)變異系數(shù)為0.17~2.43%，批間變異系數(shù)2.73~3.68%，均小于5%。表明所建立的方法較高

3、的靈敏性、很強(qiáng)的特異性、好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。根據(jù)所建立的熒光定量RT-PCR方法對臨床樣品和市售禽類疫苗進(jìn)行檢測。在所檢測的12種不同禽類疫苗中均未檢測到ALV-J，表明所檢測的市售禽類弱毒苗中無ALV-J污染。在所檢測的4個品種125只臨床疑似病雞中ALV-J陽性檢出率為46.40%（58/125），其中嶺南黃肉雞、淮南麻黃雞、地方雞種和京紅1號蛋雞的陽性檢出率分別為65.31%（32/49）、55.26%（21/38）、31.25%（5/16）和0%（0/22），表明不同品種的雞對ALV-J的

4、易感性不同。選擇10只27周齡陽性感染期嶺南黃肉雞，應(yīng)用熒光定量RT-PCR方法檢測不同臟器中ALV-J的分布及其mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中均能檢測到病毒基因，多重比較檢驗(yàn)分析顯示腎臟中ALV-J基因mRNA表達(dá)水平顯著高于其他臟器，而肺臟、心臟、肝臟和脾臟之間無明顯差異。這為進(jìn)一步研究機(jī)體與病毒之間的相互作用，以及致病機(jī)理的探明奠定了基礎(chǔ)。綜上所述，本試驗(yàn)建立的熒光定量RT-PCR方法是一種特異、快速（6h左右）和較靈敏的檢測方法，可用于快速診斷臨床樣品、凈化雞場

5、效果檢測以及在不同臟器中病毒的表達(dá)水平的研究。關(guān)鍵詞：J亞群禽白血病病毒，熒光定量PCR，定量檢測，應(yīng)用IAbstractSubgroupJAvianLeukosisreferredtochickenmyeloidcelltumorandothertumordiseasescausedbyAvianLeukosisVirussubgroupJ(ALV-J).ALV-Jwasisolatedfromcommercialbroilersforthefirsttimein1999inChina.ALV-

6、JhasspreadwidelyoverChinasince2000,anditshostrangeextendedfrommeat-typechickenstolayinghensandlocalchickenbreeds.Productionabilityofinfectedchickenswasdecreasedandthemoralitywasquicklyincreasing,whichhadbroughtgreatlossesfordomesticpoultryindustry.The

7、refore,theestablishmentofarapid,specificandsensitivemethodfordetectingALV-Jisofgreatsignificance.Inthisstudy,aSYBRGreenⅠ-basedfluorescentquantitativePCRassayfordetectingAvianLeukosisVirussubgroupJ（ALV-J）wasdevelopedandapplied.Theconservativeregionbetw

8、eenpolandgp85geneoftheHPRS-103strainofALV-JwasamplifiedbyconventionalPCRandwasclonedintopMD18-TvectorservedaspositivestandardtoestablishfluorescentquantitativePCRstandardcurve.AndthenthedetectingmethodofALV-JSYBRGreenIfluorescentquantitativePC