甲基對硫磷水解酶基因的高效表達(dá)及酶活性分析

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1、萬方數(shù)據(jù)2004年31(6)微生物學(xué)通報甲基對硫磷水解酶基因的高效表達(dá)及酶活性分析劉璐璐周亞鳳張治平劉虹張先恩。(中國科學(xué)院武漢病毒研究所武漢4姍1)摘要：假單胞菌wBc．3的甲基對硫磷水解酶基因嘶在大腸桿菌系統(tǒng)刪(DE3)，pEl32a(+)中實現(xiàn)了高效可溶性融合表達(dá)。表達(dá)的重組酶能夠有效地被親合層析純化。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，重組酶對底物乙基對硫磷水解能力較野生酶相比有近4倍的提高，對甲基對硫磷和殺螟松的水解活力無明顯變化。以融合蛋白形式存在的重組酶在室溫及4℃下的貯存穩(wěn)定性明顯優(yōu)于野生型酶。關(guān)鍵詞：有機磷水解酶，硫氧還蛋白，融合表達(dá)中圖

2、分類號：Q814．1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：0253．2654(2004)06_0cr77．06H瞰粕磐啪憾G呲D掣嘲醯嘶ofMeⅡlylP嗣憫脅ionHy由ok怫鋤dA瑚dysisofmeEl硒咖eAc吐vi鑼刪khl跚OUYa_Fe甥m心G蕊一啦姍Hongm州GⅪ趾_EIl+(№m痂腑礦臨魄y，a矗黜爿∞幽可曠&婦躑，‰430cr71)Ab醴眥：M酬刪吼吣婦(MPH，E．c．3．1．8．1)濺舭啦‰脅鋤螂?。\一3，isol砒-ed鋤did腳曲edby叫l(wèi)ab，惴鯽c。蛐鑭刪illE．∞如刪(DB)，pEl32a(+)sy3l咖鵝so

3、lllble觚冊脅ath油M．’nIe胤砌陸l舢tⅧ)H刪ne耐y4～5foldlli扣specmcacti嘶to刪加th舭血e∞zyme如mR∞幽m∞。叩．WB(：-3．hladdi6∞，thet}l∞IdgIal岫0ftheIecor曲h∞te11EyrIlew∞iII掣m硝Ⅲ一’paringwimtllewddty】pe即zyme．K叮啪柑s：m驢珊phosl)hon塢d鎦捌iIlg即可nle，m傭，c覘n，F(xiàn)hsioll懿pI鵠sion微生物能夠降解有機磷農(nóng)藥u。]。2001年我們篩選出一株甲基對硫磷降解菌，命名假單胞菌(＆舭，麟

4、sp．)WBc一3，它可以徹底降解甲基對硫磷，并以甲基對硫磷為唯一碳源和氮源生長HJ，所分離得到的甲基對硫磷水解酶(Metllylp越曲ionhydmlase，MPH，E．c．3．1．8．1)還可以降解乙基對硫磷，殺螟松和毒死俾。該酶對甲基對硫磷水解酶的比活性是對乙基對硫磷水解酶比活性的15倍[5]。對應(yīng)MPH的基因區(qū)段已經(jīng)從假單胞菌中定位，并克隆到大腸桿菌pUc一18／DH5a?！胍訢monnssp．wBc．3是天然進化的產(chǎn)物，產(chǎn)酶量有限。本實驗選擇AD494(DE3)／pErl32a(+)大腸桿菌載體系統(tǒng)，成功地實現(xiàn)了M1)H在異源宿

5、主中的大量表達(dá)，獲得重組MPH，通過對重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析意外地發(fā)現(xiàn)，重組酶對底物一乙基對硫磷的催化動力學(xué)常數(shù)發(fā)生了較大變化。本文報道有關(guān)實驗結(jié)果?！?lián)系人Td：027-87lsr7105，F(xiàn)酲：027—87199492，Bmail：婦秘@mail．Illost．穢．∞收稿日期：2004一吆．29，修回日期：20啤明．茲萬方數(shù)據(jù)1材料與方法微生物學(xué)通報2004年31(6)1．1菌株，質(zhì)粒及主要試劑飚l。dDmo麟sp．WBc一3由本實驗室分離¨j，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)AD494(DE3)，pET32a(+)由胡勤學(xué)老師提供。重組系統(tǒng)刪(DE3

6、)／pEl32a(+)一，啦，BL21(DE3)／pEB2a(+)一，礎(chǔ)，A肚I舛(DE3)／pErI’5孫，礎(chǔ)，和DH5√pUCl8一，n以均由本室構(gòu)建。限制性內(nèi)切酶、Pyrc眈stDNA聚合酶、T4DNA連接酶購自7rak鋤公司。甲基對硫磷(純度為99％)購自湖北沙隆達(dá)農(nóng)藥廠。乙基對硫磷(純度為99％)和殺螟松(純度為99％)購自沈陽化工研究所。蛋白濃度測定試劑盒系眥RCE公司產(chǎn)品。陽離子交換層析柱材料cM．sephamseFktnow為si鯽a產(chǎn)品。金屬螯合層析柱材料Ni2+一NrllA為Nov明en產(chǎn)品。TAION蹦supemow

7、Resin為cLONrIEcH產(chǎn)品。實驗中所用其它化學(xué)試劑均為分析純。PCR引物由上海生工公司合成，DNA測序由上海博亞生物工程公司完成。1．2刪咖基因的P哩擴增及克隆以質(zhì)粒pUCl8一—nph為模板，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計引物，擴增兩端帶E幻RV和硒oI位點的玎枷基因編碼序列，合成的引物為5’一GGAAGATA，I℃ArI℃CCCcrI．GAAGAA一3’和5’．CAa℃I℃GAGT℃ACrlwⅪG(汀颶Ac一3’。在50止的PCR反應(yīng)體系中含1×啪bestDNA聚合酶緩沖液，o．0002Ⅱ10l／L的心m，，o．0015In洲L的M聾+，o

8、．5止的P娜kst酶(5u／皿)。PCR條件為94℃，5IIlin；94℃，1IIlin，53℃，1IIlin，72℃，1IIlin，25個循環(huán)；72℃，10lIlin；4℃，10IIlin。