資源描述：
《蚊蟲細胞與蚊蟲組織中登革病毒受體分子篩選與鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、南方醫(yī)科大學2010級碩士學位論文蚊蟲細胞與蚊蟲組織中登革病毒受體分子篩選與鑒定Screeningandidentificationofreceptorsofdenguevirusinmosquitocellsandtissues課題來源：國家自然基金項目(N0：30872198；30972566)學位申請人導(dǎo)師姓名專業(yè)名稱培養(yǎng)類型培養(yǎng)層次所在學院潘京鄭學禮病原生物學科研型研究生公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學學院2013年5月日廣州碩士畢業(yè)論文蚊蟲細胞與蚊蟲組織中登革病毒受體分子篩選與鑒定碩士研究生：潘京指導(dǎo)
2、老師：鄭學禮教授摘要登革病毒是世界100多個國家尤其是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的蟲媒傳染病毒，近乎25．30億人處在潛在感染登革病毒的危險中，每年估計有l(wèi)億的新增感染者，導(dǎo)致約24000人死亡。目前并無有效疫苗和抗病毒藥物治療。登革病毒屬于黃熱病毒屬中的一個血清型亞群，登革病毒為單股正鏈RNA病毒，其病毒基因組編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C、膜蛋白及其前體M／prM、包膜蛋白E)和七種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)。主要由白紋伊蚊和埃及伊蚊傳播，有四種血清型
3、，其中Ⅱ型傳播最廣泛，各型病毒間抗原性有交叉，與乙腦病毒和西尼羅病毒也有部分抗原相同。病毒受體是由宿主基因組編碼、控制和表達的一組蛋白質(zhì)，它參與病毒與靶細胞的相互作用，使得病毒能夠吸附于細胞表面。病毒在受體的介導(dǎo)下最終進入細胞進行復(fù)制。細胞上的病毒受體與病毒的宿主范圍和組織嗜性密切相關(guān)登革病毒是世界范圍的重要的蟲媒傳染病盡管經(jīng)歷了幾十年的研究，然而登革病毒的復(fù)制周期還是未知的。登革病毒可以在多種昆蟲和哺乳動物細胞培養(yǎng)中增殖，并引起培養(yǎng)細胞發(fā)生折光性增強、細胞變圓或細胞融合等不同程度的細胞病變。在哺
4、乳類細胞中的研究報道了大量細胞表面的登革病毒受體，其與細胞的種類和病毒的類型有關(guān)。哺乳動物的受體蛋白包括：細胞連接分子DC．SIGN(凝集素C受體)，37／67kDa高親和層粘連蛋白受體，及熱休克蛋白HSP70／90。摘要然而，昆蟲細胞上的登革病毒受體并沒有鑒定，主要的鑒定僅僅限制在分子量的大小上。然而目前大部分研究都沒有區(qū)別是病毒連接分子還是作用分子，對于篩選出的分子與登革病毒的作用功能研究甚少。蟲媒媒介效能與產(chǎn)生媒介感染的媒介屏障有關(guān)，主要包括中腸感染屏障(midgutinfectionbar
5、rier，MIB)、中腸逃逸屏障(midgutescapebarrier，MEB)、唾液腺播散屏障(salivaryglandstransmissionbarrier)。如果存在MIB，病毒就不能在蚊蟲中腸細胞中感染或復(fù)制，這可能是由于細胞表面缺乏病毒受體。而MEB的存在，使病毒只能在中腸復(fù)制而不能播散，進一步感染二級靶器官。迄今為止，蚊傳黃病毒與蚊蟲中腸上皮細胞受體的相互作用機制還不十分清楚。本文在研究登革病毒受體的初選時，選用蚊蟲的中腸組織作為主要研究對象，也是基于此媒介屏障的理論。在選用C6
6、／36細胞作為潛在登革病毒受體的篩選的載體，研究甚多，研究者利用VOPBA(virusoverlayproteinbindingassay)病毒覆蓋蛋白結(jié)合試驗，將提取的C6／36細胞膜蛋白通過SDS．PAGE分離，轉(zhuǎn)到固體膜上，再將純化的登革病毒覆蓋結(jié)合蛋白，通過針對登革病毒的單抗識別結(jié)合的病毒間接篩選出特異性蛋白條帶。該方法早期由M6xico等應(yīng)用在白紋伊蚊系C6／36細胞中篩選登革II型病毒潛在受體，篩選出主要的分子為分子量約67000和80000的多肽。這為后來的登革受體研究在方法學上做了
7、初步的探索，至今研究篩選受體分子應(yīng)用VOPBA作為初步篩選是較為理想的方法，國內(nèi)外研究者外對此方法也不斷改進，在登革病毒受體研究上取得很大進展，用上述方法Munoz等在C6／36細胞中鑒定出分子量67kDa和80kDa的兩種蛋白為DV2的受體蛋白，尤其是分子量為67kDa的蛋白其多克隆抗體夠抑制DV2連接感染C6／36。之后的研究建議把這兩種蛋白作為四型登革病毒的受體蛋白。Chee等用VOPBA的方法篩選出分子量為48kDa的分子，之后第一次用質(zhì)譜分析的方法鑒定出該分子為微管樣蛋白，微管蛋白在最初
8、并不參與病毒內(nèi)化作用，而是在后階段的內(nèi)化或是在搬運病毒顆粒發(fā)揮作用。在早期的研究中Salas．Benito等在C6／36細胞膜蛋白中鑒定出兩種蛋白40kDa／45kDa，作為DV4的連接分子。并用親和柱色譜法鑒定出這碩士畢業(yè)論文兩種蛋白與重組登革病毒E蛋白相互作用，最終證明這兩種蛋白為糖蛋白，盡管碳水化合物部分并未參與連接作用，之后的研究建議將該蛋白作為熱休克蛋白(Hsp)90。通過抗體介導(dǎo)和小片段RNA介導(dǎo)的干擾下調(diào)抑制素基因的方法來確定抑制素介導(dǎo)病毒進入昆蟲細胞的作用。發(fā)現(xiàn)抑制
