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《兔抗小麥鈣調(diào)素抗血清的制備及其純化》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、第31卷第6期河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)Vol.31No.62008年11月JOURNALOFAGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEINov.2008文章編號(hào):1000-1573(2008)06-0055-04①兔抗小麥鈣調(diào)素抗血清的制備及其純化黃晨,侯春燕,王冬梅(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定071001)摘要:為制備兔抗小麥鈣調(diào)素抗血清并對(duì)其進(jìn)行純化,首先從小麥葉片中提取鈣調(diào)素蛋白,對(duì)其初步純化后免疫家兔,制備得到兔抗小麥鈣調(diào)素抗血清,再以大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的擬南芥鈣調(diào)素蛋白作為抗原,利用PVDF膜結(jié)合法純化得到了兔抗小麥鈣調(diào)素抗血清,并通過(guò)W
2、esternBlotting對(duì)所純化的多克隆抗體進(jìn)行了鑒定。關(guān)鍵詞:鈣調(diào)素;多克隆抗體;純化;WesternBlotting中圖分類號(hào):Q942.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:APreparationandpurificationofrabbitanti2wheatcalmodulinantiserumHUANGChen,HOUChun2Yan,WANGDong2mei(CollegeofLifeScience,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001,China)Abstract:Toprepareandpurifyrabbita
3、nti2wheatcalmodulinantiserums,calmodulinproteinwasextractedfromwheatleavesforimmunedrabbitsafterpreliminarypurification.ThenArabidopsisthalianacalmodulinproteinwasusedbyE.coliinducedexpressionasantigentopurifyrabbitanti2wheatcalmodulinantiserumbyPVDFmembranebinding.Thepurifiedpolyclo
4、nalantibodywasi2dentifiedbytheWesternBlotting.Keywords:calmodulin;polyclonalantibody;purification;WesternBlotting2+鈣調(diào)素(Calmodulin,CaM)作為Ca的多功能受CaM分子量小(17kD),在進(jìn)化上高度保守,使其免疫2+體蛋白在鈣信號(hào)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用,因此Ca/源性較弱,難于制備高效價(jià)抗體。本研究以初步純化CaM是目前植物細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)中研究得最為深入和的小麥CaM蛋白為抗原免疫家兔制備抗血清,并對(duì)2+廣泛的途徑之一。毛愛(ài)軍等的工作初步表
5、明,Ca/抗血清進(jìn)行了純化,以期為深入探討不同亞型CaMCaM參與了小麥抵抗葉銹菌侵染誘發(fā)的過(guò)敏性反應(yīng)的亞細(xì)胞定位準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。[1](Hypersensitivereaction,HR),為了進(jìn)一步深入探討1材料與方法CaM在小麥抵抗葉銹菌侵染誘發(fā)的HR中的作用,制備小麥CaM特異性抗體是必須的,它是CaM定位、1.1材料定量及生理功能研究中最有效、最特異的試劑。由于1.1.1供試小麥品種以小麥(Triticumaestivum①收稿日期:2008-04-22基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30671244);植物生理學(xué)與生物化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課
6、題資助項(xiàng)目(No.PPB04006);河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.303180;No.C2005000220;No.C2007000515)作者簡(jiǎn)介:黃晨(1983-),男,河北邢臺(tái)人,碩士,主要從事生理生化研究工作.通訊作者:王冬梅(1963-),女,河北景縣人,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事逆境分子細(xì)胞生物學(xué)等研究工作.Tel:0312-7528247,E-mail:dongmeiwang63@hotmail.com56河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第31卷L.)品種洛夫林10為試材。小麥幼苗用直徑15cm1.2.4擬南芥CaM蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)參照文獻(xiàn)的花盆土培,生
7、長(zhǎng)于人工氣候培養(yǎng)室,晝/夜溫度為[5]的方法并稍做改進(jìn)。將帶有擬南芥CaM重組子225/20℃,鏑燈照射,光照強(qiáng)度為400W/m,光照周的大腸桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基上,在搖床中期14h/d。小麥幼苗7日齡時(shí)取葉片提取CaM。37℃培養(yǎng)過(guò)夜。取過(guò)夜培養(yǎng)基接種于LB培養(yǎng)基液1.1.2供試動(dòng)物家兔2只,購(gòu)自保定兔場(chǎng)。體擴(kuò)繁,在搖床中37℃培養(yǎng)直到細(xì)菌密度達(dá)到1.1.3供試菌種含pET28-CaM(擬南芥CaM)重OD600=015,向培養(yǎng)基中加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)CaM,組表達(dá)質(zhì)粒的BL21(DE3)工程菌,由河北師范大學(xué)37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后以5000×g離心10
8、min,細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室
