wxxw基序對adamts13分泌及功能影響

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1、WXXW基序對ADAMTS13分泌及功能的影響中文摘要WXXW基序對ADAMTS13分泌及功能的影響中文摘要ADAMTS13，又稱為血管性血友病因子水解蛋白酶（VWF-CP），是存在于血漿中的金屬蛋白酶，隸屬于ADAMTSs（adisintegrinandmetalloproteinasewiththrombospondinmotifs）金屬蛋白酶超家族。人ADAMTS13基因于2001年首次被克隆報導，定位于9號染色體長臂端（9q34）?；蛉L37kb，主要由29個外顯子組成，其基因表達開放閱讀框為42

2、84bp，編碼1427個氨基酸。ADAMTS13蛋白主要由9個結構功能域組成，從氨基端到羧基端依次為：信號肽、前導肽、金屬蛋白酶結構域、去整合素結構域、凝血酶敏感蛋白1（TSP1）第1基序、富半胱氨酸區(qū)域、間隔區(qū)、凝血酶敏感蛋白1（TSP1）第2-8重復基序、補體結合區(qū)域（CUB）。ADAMTS13主要通過水解人血管性血友病因子（VWF），降解血漿中超大分子量VWF多聚體，使其對血小板的黏附與聚集能力降低，從而抑制血栓形成。ADAMTS13酶活性降低與血栓性血小板減少性紫癜（TTP）的發(fā)病密切相關。目前研究

3、發(fā)現(xiàn)，ADAMTS13金屬蛋白酶結構域識別并水解VWF蛋白A2區(qū)第1605酪氨酸殘基和1606位蛋氨酸殘基間肽鍵。而ADAMTS13金屬蛋白酶結構域臨近的羧基端結構域，包括去整合素結構域、凝血酶敏感蛋白1（TSP1）第1基序、富含半胱氨酸結構域、間隔區(qū)，確保ADAMTS13對VWF的正確識別及有效的水解。本文圍繞ADAMTS13的結構與功能進行研究，主要包括三個部分：1）構建了ADAMTS13的TSR1結構域中WXXW基序突變體（W387A），觀察其對ADAMTS13分泌及酶活性的影響；2）構建了ADAMT

4、S13-pEGFP-N1綠色熒光真核表達載體，為研究ADAMTS13細胞內(nèi)合成及轉運過程提供有力的研究工具；3）獲得了多株分泌抗ADAMTS13的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，以備進一步單克隆抗體分選及功能研究。一、WXXW基序對ADAMTS13分泌及功能的影響WXXW基序在凝血酶敏感蛋白1蛋白超家族中普遍存在，其中包括ADAMTSs金屬蛋白酶家族。對于WXXW基序的研究主要集中在凝血酶敏感蛋白1蛋白上，此基序被認為是凝血酶敏感蛋白1蛋白結合并活化TGF-β（transforminggrowthfactor-β

5、）所必需的。在對霍亂毒素分泌蛋白EpsM的研究中發(fā)現(xiàn)，WXXW基序中芳香族氨基酸殘基之間的相互作用可能與跨膜蛋白質的二聚化有關。WXXW基序在ADAMTSs金屬蛋白酶家族中普遍存在，然而，其功能尚未可知。為了研究該基序的功能，我們構建了WXXW基序的突變體W387A的真核表達載體。首先，我們用野生型ADAMTS13及W387A突變體的真核表達載體瞬時轉染HeLa細胞，轉染后48小時收集培養(yǎng)上清及細胞。將濃縮后培養(yǎng)上清及細胞裂解液行SDS-PAGE電泳及westblot，通過灰度值測定判斷上清及細胞裂解液中蛋

6、白的含量。用培養(yǎng)上清中蛋白含量除以培養(yǎng)上I中文摘要WXXW基序對ADAMTS13分泌及功能的影響清及細胞裂解液中蛋白總量，計算蛋白的分泌量。實驗結果表明：野生型ADAMTS13上清中蛋白含量為72.38%±10.70%，細胞裂解液中為27.62%±9.56%；而W387A突變體上清中蛋白含量為20.46%±5.85%，細胞裂解液中為79.54%±5.46%。結果表明，W387A突變抑制了ADAMTS13的分泌，使得大量的ADAMTS13蛋白積蓄在細胞內(nèi)。蛋白細胞內(nèi)定位實驗結果顯示，野生型蛋白細胞內(nèi)分布呈指環(huán)

7、狀，而突變體蛋白細胞內(nèi)分布彌散，提示突變體蛋白更多地滯留在內(nèi)質網(wǎng)中。其次，我們構建了穩(wěn)定表達野生型ADAMTS13及W387A突變體蛋白的HeLa細胞株，并擴大培養(yǎng)，收集無血清培養(yǎng)上清，從而獲得野生型ADAMTS13及W387A突變體蛋白，并進一步完成ADAMTS13功能檢測。第三，我們用非變性的人血漿來源VWF（pVWF）及經(jīng)過預變性處理的pVWF包板，再分別加入野生型ADAMTS13或W387A突變體蛋白進行孵育，通過ELISA的方法，測定重組ADAMTS13蛋白與pVWF結合的量。結果表明，與野生型A

8、DAMTS13相比，W387A突變體與變性的pVWF結合能力明顯降低，而與非變性的pVWF的結合能力與野生型ADAMTS13沒有明顯區(qū)別。第四，我們分別在變性條件下及高剪切力條件下，以pVWF為底物，檢測了野生型ADAMTS13及W387A突變體對pVWF的水解能力。通過還原條件下的5%SDS-PAGE電泳及westernblotting方法，分析176kDa分子量大小的酶切產(chǎn)物生成量，從而判斷重組ADAMTS1