東北七鰓鰻Toll樣受體信號通路基因表達(dá)研究

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1、上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文學(xué)校代碼:10264研究生學(xué)號:M150104139上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文東北七鰓鰻Toll樣受體信號通路基因題目:表達(dá)研究GenesExpressionAnalysisofToll-LikeReceptor英文題目:SignalingPathwayinNortheastChineselamprey(Lethenteronmorii)專業(yè):臨床獸醫(yī)學(xué)研究方向:分子免疫學(xué)姓名:丁少青指導(dǎo)導(dǎo)師:張慶華副教授二O一八年五月二十九日上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文上海海洋大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明:我恪守學(xué)術(shù)道德,崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文,是本人在導(dǎo)師的指

2、導(dǎo)下,獨立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)明確注明和引用的內(nèi)容外,本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫,我對所寫的內(nèi)容負(fù)責(zé),并完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名:日期:年月日上海海洋大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定,同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版,允許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)上海海洋大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密□,在年解密后適用本版權(quán)書。本學(xué)位

3、論文屬于不保密□學(xué)位論文作者簽名:指導(dǎo)教師簽名:日期:年月日日期:年月日上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯委員會成員名單姓名工作單位職稱備注中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)曾令兵研究員主席研究所杜昌升同濟(jì)大學(xué)教授委員孫建和上海交通大學(xué)教授委員嚴(yán)亞賢上海交通大學(xué)教授委員顏標(biāo)復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院研究元委員季策上海海洋大學(xué)博士生秘書水產(chǎn)與生命學(xué)院D101病原庫會答辯地點答辯日期2018.5.29議室上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文東北七鰓鰻Toll樣受體信號通路基因表達(dá)研究摘要七鰓鰻是一種古老的無頜類動物,在進(jìn)化上處于無脊椎動物和脊椎動物之間,對免疫系統(tǒng)的研究在理論上有著重要

4、的進(jìn)化意義。Toll樣受體是非特異性模式識別受體(pattern-recognitionreceptors,PRRs),能夠識別病原體,是啟動先天免疫的關(guān)鍵。本研究克隆獲得東北七鰓鰻(Lethenteronmorii)TLR7a、TLR7b、TLR14d和TLR2d基因,利用實時熒光定量PCR分析4個TLR基因在幼魚和成魚中各組織的表達(dá)情況以及在銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)刺激后不同組織在不同時間點的表達(dá)量變化。構(gòu)建真核表達(dá)載體并檢測TLR14d和TLR2d在HEK293T細(xì)胞中的定位。為深入探索TLR基因的功能及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,本研究也進(jìn)行TLR通

5、路相關(guān)接頭分子(MyD88和TRAF6)以及下游轉(zhuǎn)錄因子NF-?B家族成員及其啟動子的研究,現(xiàn)取得以下結(jié)果:1.東北七鰓鰻TLR基因克隆及生物信息學(xué)分析:采用克隆技術(shù)獲得4個TLR基因的cDNA序列,TLR7a、TLR7b、TLR14d和TLR2d的開放閱讀框(ORF)分別為3252bp、3117bp、2241bp和2439bp;編碼1083、1038、746和812個氨基酸。除了TLR14d缺少LRR結(jié)構(gòu)域,另外的3個TLR均具有LRR結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)和TIR結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,TLR7a、TLR7b分別與哺乳類以及魚類的TLR7聚為一支;TLR14d、TLR2d分別與哺乳類

6、、鳥類、兩棲類以及硬骨魚類的TLR2亞家族聚為一支,其中TLR14d與紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)TLR14的親緣關(guān)系最近。2.東北七鰓鰻TLR基因組織表達(dá)分析:利用獲得的東北七鰓鰻TLR基因的cDNA序列,設(shè)計定量引物,熒光定量PCR的結(jié)果顯示,TLR基因在健康東北七鰓鰻幼魚和成魚所檢測的組織中均有表達(dá)。4個TLR基因在幼魚的心中均有最高的表達(dá)量;TLR7b、TLR14d在成魚的腦中均有最高的表達(dá)量。除此之外,這4個TLR基因均在免疫相關(guān)組織中有較高的表達(dá)量,如脂肪體、肝、皮膚等。熒光定量PCR分析TLR基因在銅綠假單胞菌刺激后的表達(dá)量變化,結(jié)果顯示,TLR基

7、因可以被細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá),但是不同組織在不同時間點的表達(dá)情況不同,TLR7a表達(dá)量在脂肪體、鰓、腸、腎中顯著上調(diào);TLR7b表達(dá)量在脂肪體和腎中顯著上調(diào);TLR14d表達(dá)量在脂肪體、鰓、腎中顯著上調(diào);TLR2dI上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文表達(dá)量在脂肪體、鰓、腎中顯著上調(diào),但是在腸中顯著下調(diào)。3.東北七鰓鰻TLR基因亞細(xì)胞定位:將pCMV-TLR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,觀察其在細(xì)胞中的定位情況。結(jié)果表明,TLR14d定位于細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)及多個細(xì)胞器中;TLR2d定位于細(xì)胞的

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