豬圓環(huán)病毒2型gem顆粒疫苗的初步研究

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1、豬圓環(huán)病毒2型GEM顆粒疫苗的初步研究GEMParticleVaccinesforPorcinecircovirustype2研究生：喬緒穩(wěn)專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)導(dǎo)師：高崧教授侯繼波研究員鄭其升副研究員揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院2013年5月喬緒穩(wěn)：豬圓環(huán)病毒2型顆粒疫苗的初步研究豬圓環(huán)病毒2型GEM顆粒疫苗的初步研究研究生：喬緒穩(wěn)LIYIII[112111[[14I[111[IIl911[11211[[171[IIH4I導(dǎo)師：高崧教授?侯繼波研究員鄭其升副研究員中文摘要PCV2是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原之一，造成宿主生長緩慢，免疫機(jī)能下降，易

2、與豬皮炎腎病綜合癥(PDNS)、豬呼吸系統(tǒng)疾病、豬支原體肺炎等一種或多種疾病共發(fā)，對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。國產(chǎn)PCV2傳統(tǒng)滅活疫苗免疫效果不十分理想，主要原因是細(xì)胞增殖病毒滴度低和免疫抑制。因此，研制安全、高效、廉價(jià)的PCV2亞單位疫苗，替代進(jìn)口同類產(chǎn)品，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。GEM(Grampositiveenhancermatrix)顆粒表面展示系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的新技術(shù)，國外已有應(yīng)用該技術(shù)研制新型人用疫苗的多篇報(bào)道。GEM是將乳酸菌經(jīng)熱酸處理、去除細(xì)菌原有蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)后獲得的細(xì)胞壁肽聚糖骨架，具有特異性非共價(jià)結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞壁水解酶C

3、端結(jié)構(gòu)域(ProteinAnchor，PA)的特性。因此，與PA融合表達(dá)的目標(biāo)抗原，可以高密度地展示在GEM顆粒表面。該系統(tǒng)用于研發(fā)新疫苗的獨(dú)特優(yōu)勢包括：一是后期抗原純化僅需低速離心即可，疫苗制備快速、價(jià)廉；二是GEM顆粒的主要成分肽聚糖本身具有免疫增強(qiáng)功能，可提高疫苗免疫效力；三是GEM顆粒源自食品級(jí)乳酸菌，與目標(biāo)抗原結(jié)合、離心純化后無核酸殘留，因此無生物安全風(fēng)險(xiǎn)。本文應(yīng)用GEM顆粒表面展示系統(tǒng)，成功研制出表面展示PCV2．Cap蛋白的GEM顆粒疫苗，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)表明，PCV2．Cap．PA融合蛋白產(chǎn)量高，GEM顆?？乖庖咴?/p>

4、好，為研$1JPCV2新型亞單位疫苗打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。1．GEM．PA系統(tǒng)基礎(chǔ)構(gòu)件的制備與鑒定GEM顆粒制備與鑒定。離心收集GMl7培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)的乳酸乳球菌(MGl363株)，菌體洗滌后用0．1mol／L的HCl重懸，煮沸30min，洗滌后計(jì)數(shù)。規(guī)2揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文定2．5×109GEM顆粒為1U，將其濃度調(diào)整為10U／ml，．80。C保存?zhèn)溆?。透射電子顯微鏡觀察表明，GEM顆粒保持細(xì)菌原有骨架外形和大小，表面較為平滑，內(nèi)部呈現(xiàn)均一的灰色，證明細(xì)菌原有蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)均已完全去除。錨鉤蛋白PA制備與鑒定。以乳酸乳球菌(MGl363株)基因組

5、RNA為模板，利用RT-PCR方法，分別獲得含有2、3+LySMs基序的基因片段，連入表達(dá)載體pET-32a(+)中，原核誘導(dǎo)表達(dá)，獲得37kDa和29．4kDa兩個(gè)蛋白質(zhì)，均為包涵體形式表達(dá)，分別命名為PA2和PA3。GEM與PA特異性結(jié)合鑒定。lUGEM顆粒離心，分別用500燼復(fù)性后PA2和PA3蛋白重懸，室溫孵育30min，離心收集沉淀。SDS．PAGE鑒定其結(jié)合效果。結(jié)果表明，PA2和PA3蛋白均能與GEM結(jié)合，但PA3與GEM顆粒結(jié)合活性明顯要優(yōu)于PA2。透射電子顯微鏡觀察表明，GEM顆粒結(jié)合PA蛋白后，在其表面形成一層十分明顯的絮狀物。2．

6、PCV2．Cap蛋白顆?？乖苽渑c鑒定融合蛋白的制備與鑒定。以PCV2(NJ株)DNA為模板，獲得ORF2基因。分別構(gòu)建PA與PCV2．CapN端和C端相連的兩種融合基因的重組質(zhì)粒pQZ-PA3-Cap和pQZ—Cap-PA3，利用大腸桿菌可溶性表達(dá)平臺(tái)CVCll02對(duì)融合基因進(jìn)行表達(dá)。SDS．PAGE鑒定表明，獲得融合蛋白為44．6KD，Cap．PA3表達(dá)量要遠(yuǎn)低于PA3．Cap的表達(dá)量。其中，PA3．Cap約60．70％為可溶性表達(dá)。Western．blotting分析顯示，兩種融合蛋白與豬PCV2特異性抗血清呈陽性反應(yīng)。融合蛋白與GEM顆粒結(jié)合特

7、性鑒定。取1UGEM顆粒各與2mlCap．PA3、PA3．Cap蛋白室溫下結(jié)合，分別進(jìn)行SDS．PAGE、電子顯微鏡觀察及間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定。結(jié)果表明，兩種重組蛋白均可與GEM顆粒特異性結(jié)合，結(jié)合后的GEM顆粒表面形成一層較厚的PA．Cap蛋白層，該層蛋白可與PCV2特異性熒光抗體結(jié)合。此外，本章研究還建立了GEM．PA．Cap完全解離的SDS加熱方法，用于PA3．Cap抗原定量分析。3．PCV2．Cap顆粒抗原免疫原性初步研究制備PA3．Cap融合蛋白，與GEM顆粒結(jié)合后，獲得PCV2．GEM顆粒抗原，PA3-Cap含量為1mg／mL。按照100g

8、g／頭的劑量，PCV2-GEM顆粒抗原分別不同的佐劑混合乳化，獲得試驗(yàn)性疫苗，4。C保存?zhèn)溆谩?/p>