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2、師簽。名El期：之!垡：至：翌El期：趁：妄：12＆素蛋自作為促血管生長(zhǎng)基周載體的研究中文摘要絲素蛋白作為促血管生長(zhǎng)基因載體的研究中文摘要血管的再生是組織工程及原位組織再生領(lǐng)域面臨的關(guān)鍵問(wèn)題。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將促進(jìn)血管再生的生長(zhǎng)因子基因?qū)О四康募?xì)胞并使其表達(dá)，可有效促進(jìn)血管生成。VEGFl65和Ang．1是兩種最重要的促血管再生生長(zhǎng)因子。VEGF作用于血管形成的早期，促進(jìn)原始血管網(wǎng)的形成，Ang-1則作用于其后的血管改建、塑形，促進(jìn)形成成熟的且具有空間結(jié)構(gòu)的血管網(wǎng)。聯(lián)合使用VEGFl65和Ang-1雙基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，則既有利于相互協(xié)調(diào)共同促
3、進(jìn)血管的形成，又可使新生血管獲得持久穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。為了將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，需要依靠基因傳遞載體。分子量為25kDa的支鏈PEI是迄今最成功的非病毒高分子基因載體，其表面帶有高密度的正電荷．轉(zhuǎn)染效率較高，但細(xì)胞毒性較大。絲素蛋白是一種具有良好細(xì)胞相容性和可降解性的蛋白質(zhì)，絲素分子帶負(fù)電，不能直接包裝DNA．但是能夠屏蔽PEI多余的正電荷，減小細(xì)胞毒性。同時(shí)柞蠶絲素蛋白內(nèi)存在細(xì)胞特異性粘附序列RGD，可以與血管內(nèi)度細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等細(xì)胞表面的受體發(fā)生特異性相互作用a因此，用絲素和PEI共同包裝質(zhì)粒DNA，作為基因傳遞載體，可以通過(guò)細(xì)胞表面受體
4、介導(dǎo)的特異性相互作用及其內(nèi)吞作用，代替PEI和細(xì)胞的非特異性靜電相互作用，以降低細(xì)胞毒性，提高轉(zhuǎn)染效率。本文以絲素和PEI共同作為VEGFl65和Ang-1職基因共表達(dá)質(zhì)粒的傳遞載體，研究與PEI單獨(dú)作為傳遞載體相比，載體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)的變化，及其對(duì)細(xì)胞毒性、轉(zhuǎn)染效率的影響，并對(duì)其影響機(jī)制進(jìn)行初步探討。首先，通過(guò)靜電吸附方法制備PEI／DNA復(fù)合物，DNA的含量為2ag／ml。用瓊脂糖凝膠電泳確定能完全包被質(zhì)粒時(shí)，PEI與DNA的N／P比大于3。MTT法證明，細(xì)胞培養(yǎng)液中PEI含量在I-5．g／m1時(shí)，細(xì)胞存活率都在90％Og上，
5、細(xì)胞毒性較低。PEI含量為3ug／mi時(shí)(其中，PEI／DNA復(fù)合物的含量為5刪，DNA的含量為2I．tg／m1)，熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，轉(zhuǎn)染效率最大，且細(xì)胞毒性較低。其次，分別用柞蠶絲素(Antheraeapernyisilkfibroin,ASF)和家蠶絲素(Bomb?ixI中文摘要＆寨蛋自作為促m管生長(zhǎng)基因載體的研究morisilk丘broin,BSF)包被pEI／DNA，得到ASF／PEI／DNA和BSF／PEUDNA復(fù)合物。用x．射線能譜分析了復(fù)合物表面元素的含量變化，證明蠶絲絲素可以結(jié)合到PEI／DNA表面。原子力顯微鏡(AFM)和激
6、光粒度儀∞Ls)測(cè)試結(jié)果顯示ASF和BSF都可以包被PEUDNA形成納米級(jí)顆粒，PEVDNA的平均粒徑為2743±34nm，ASF／PEI／DNA的平均粒徑是3376士74nm，SF／PEI／DNA復(fù)合物的粒徑與PEI／DNA相比有所增大。ASF／PEI／DNA和BSF／PEI／DNA的表面電位與PEl／DNA相比有明顯降低。SF／PEI／DNA三元復(fù)合物能抵抗核酸酶的降解。晟后，分別用ASF／PEI／DNA和BSF／PEI／DNA轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察轉(zhuǎn)染情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白(GFP)陽(yáng)性細(xì)胞比率
7、。結(jié)果表明，ASF／PEI／DNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率比PEI／DNA復(fù)合物的高。轉(zhuǎn)染CHL細(xì)胞后，出現(xiàn)了相似的結(jié)果。IVITT法鍘試結(jié)果顯示ASF／PEI／DNA組的細(xì)胞存活率大于PEI／DNA組的細(xì)胞存活率。用ASF與PEI共包被DNA后，一方面能夠通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，增強(qiáng)復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的靶向性：另一方面能降低復(fù)合物的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和功能良好，有利于轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而提高VEGF—An爭(zhēng)1雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的基因轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染攜帶雙基因片段的質(zhì)粒后，VEGF的分泌比同種條件下的攜帶單基因的質(zhì)粒組分泌的VEGF多。同一時(shí)間點(diǎn)，
8、ASF／PEI／DNA組細(xì)胞比其它組細(xì)胞分泌的VEGF多。證明用ASF與PEI共同包被DNA，不僅能夠提高轉(zhuǎn)染效率，而且轉(zhuǎn)染后的VEGF基因能夠正常表達(dá)、分泌VEGF。本文首次用柞蠶絲素蛋白和
