鐮形扇頭蜱p0基因的克隆及其雙鏈rna(dsrna)殺蜱效果的研究

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1、郎＊５５９０５８．學(xué)校代碼７分類號(hào)：：１１２３６０２０３１６密級(jí)：公開：．學(xué)號(hào)Ｊ？覆《令乂＃碩±學(xué)位論文鑛彩扇頭蝸Ｐ０基因的克隆及其雙鏈ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）殺蝸效果的研究ＣｌｏｎｅａｎｄｔｈｅＥｆｆｅｃｔＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＤｓＲＮＡｓ化ｒＴｉｃｋｉｃｉｄｅｏｆ—？ＲｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓＨａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓＰＯＧｅｎｅ研究生姓名張玉婷導(dǎo)師姓葦及職稱己音查汗教授合作導(dǎo)師姓名及職稱周金林研究貝學(xué)位口類紋別農(nóng)學(xué)碩去專業(yè)名稱頑防善醫(yī)學(xué)研究方向寄生蟲免疫學(xué)及原蟲分子生物學(xué)

2、所在學(xué)院動(dòng)物度學(xué)學(xué)院新疆？烏魯木齊■二－〇五年五月＇■■／．：‘：＇戶．Ｉ＇＊＇＾．．ＬＩ獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加Ｗ標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得新一疆農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育單位的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：時(shí)間：年＾月／／日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的說明本人完全了解新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使

3、用學(xué)位論文的規(guī)定，良Ｐ：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部口或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文檔，可采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)將學(xué)位論文的全部或部分部?jī)?nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可Ｗ公布（包括刊登）論文的全部或分內(nèi)容。（保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議）研究生簽名；恭走時(shí)間：年月／／日＾導(dǎo)師簽名：時(shí)間：＾／月曰戶作本研究得到如下項(xiàng)目資助：新疆維吾爾自治區(qū)科技支撐課題-科技支疆項(xiàng)目（項(xiàng)目編：2013911061）和比爾及梅琳達(dá)·蓋茨基金挑戰(zhàn)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：OPP1098706）的部分研究

4、成果第一個(gè)項(xiàng)目主持人：巴音查汗教授（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)）第二個(gè)項(xiàng)目主持人：周金林研究員（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所）本文是在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所完成鐮形扇頭蜱P0基因的克隆及其雙鏈RNA（dsRNA）殺蜱效果的研究摘要蜱，作為專性體表寄生蟲，主要侵襲哺乳類、鳥類、爬行類以及兩棲類等，其危害不僅在于攝食人和宿主動(dòng)物的血液，還可通過吸血傳播病毒、細(xì)菌和原蟲等病原，引起人和動(dòng)物的發(fā)病。目前主要通過化學(xué)防治來(lái)進(jìn)行蜱的防控，但該方法會(huì)污染環(huán)境、危害食品安全等。新型防控方法，如疫苗和生物防治，都還未取得成功，因此急需研發(fā)其他新型防控蜱的技術(shù)。近年來(lái)，RNAi已經(jīng)應(yīng)用于蜱、蚊子等各種動(dòng)物的基因功能

5、研究中。因此，本研究在RNAi的原理基礎(chǔ)上，選擇P0作為靶基因，對(duì)雙鏈RNA作為潛在的殺蜱劑進(jìn)行探索。本研究通過3'RACE和5'RACE的方法從鐮形扇頭蜱中克隆了P0全長(zhǎng)基因。將該基因的ORF克隆至pGEX-4T-1，構(gòu)建P0/pGEX-4T-1重組質(zhì)粒，使P0基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。P0重組蛋白免疫小鼠后，制備抗血清，進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果顯示，P0基因全長(zhǎng)序列為1118bp，具有一個(gè)編碼319個(gè)氨基酸的開放閱讀框，推測(cè)P0的蛋白大小約為35ku，沒有信號(hào)肽序列。P0與其他蜱種具有很高的同源性，本研究獲得的P0基因與微小扇頭蜱、長(zhǎng)角血蜱的該基因相似性分別為94%、87

6、%。原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組蛋白大小為60ku，Westernblot分析顯示重組蛋白制備的小鼠血清可以識(shí)別鐮形扇頭蜱體內(nèi)的唾液腺蛋白。體外合成P0雙鏈RNA和Luciferase雙鏈RNA。將三種轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、CellfectinⅡ和DMRIE-C與雙鏈RNA混合后浸染鐮形扇頭蜱的各個(gè)發(fā)育階段優(yōu)化最佳轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染試劑與雙鏈RNA的最佳混合比例以及最佳浸染時(shí)間。將優(yōu)化的最佳條件浸染各個(gè)發(fā)育階段的蜱之后，觀察生物學(xué)特性。結(jié)果顯示：對(duì)成蜱、若蜱和幼蜱，最佳轉(zhuǎn)染試劑均為DMRIE-C；針對(duì)成蜱和幼蜱，轉(zhuǎn)染試劑與雙鏈RNA的最佳混合比例是1:1，而若蜱，兩者的最佳混

7、合比例是1:2；成蜱、若蜱的最佳浸染時(shí)間分別為12h、6h，而幼蜱的最佳浸染時(shí)間則是24h。殺蜱試驗(yàn)表明蜱體內(nèi)的P0基因被沉默后，會(huì)影響蜱吸血的相關(guān)生物學(xué)特性，比如：降低24h吸附率、降低平均飽血體重、延長(zhǎng)平均飽血時(shí)間等，甚至導(dǎo)致蜱死亡。本研究證實(shí)了鐮形扇頭蜱P0基因沉默情況下對(duì)蜱生活史的完成造成嚴(yán)重影響，甚至阻礙其發(fā)育繁殖并導(dǎo)致死亡，成為一種可能的抗蜱疫苗候選分子，可為蜱和蜱傳病的防治提供科學(xué)依據(jù)。關(guān)鍵詞：鐮形扇頭蜱；P0；基因克