gmbri1和gmcpd基因的克隆及在大豆開花過程中的功能研究

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1、—————————————————————GmBRI1和GmCPD基因的克隆及在大豆開花過程中的功能研究—————————————————————FunctionalAnalysisofGmBRI1andGmCPDandInvestigationofTheirRolesinSoybeanFlowering————————————作者姓名：王妙專業(yè)名稱：植物學(xué)研究方向：植物種質(zhì)資源與利用指導(dǎo)教師：王慶鈺教授學(xué)位類別：理學(xué)博士培養(yǎng)單位：吉林大學(xué)論文答辯日期：2015年6月3日授予學(xué)位日期：年月日論文評閱人：答辯委員

2、會組成：姓名職稱工作單位姓名職稱工作單位專家1教授單位1主席王丕武教授吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)專家2教授單位2委員宋慧教授吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)專家3教授單位3王樹才教授東北師范大學(xué)專家4教授單位4梁正偉研究員中國科學(xué)院東北地理所專家5教授單位5馮獻忠研究員中國科學(xué)院東北地理所潘洪玉教授吉林大學(xué)原亞萍教授吉林大學(xué)中文摘要GmBRI1和GmCPD基因的克隆及在大豆開花過程中的功能研究隨著人口的快速增長，全世界的糧食安全面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。要使作物產(chǎn)量大幅度提高，必須對產(chǎn)量賴以形成的植物總體的生長發(fā)育狀況進行重大調(diào)控。因此，更多研究開始關(guān)注控

3、制或影響植物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的物質(zhì)——植物激素。油菜素內(nèi)酯是第六大植物激素，參與調(diào)控植物生長發(fā)育的多個方面，其對株型、產(chǎn)量和花期的調(diào)控尤其被世人關(guān)注。對油菜素內(nèi)酯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和生物合成途徑的關(guān)鍵基因進行遺傳操作，是改造植物株型和生育期，挖掘作物高產(chǎn)潛能的有力途徑。大豆作為世界上最為重要的油料作物和高蛋白糧食作物，一直被倒伏和生育期復(fù)雜所困擾。以往育種者通過常規(guī)育種手段改良株型及生育期性狀，但隨著近年來生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，尤其是一系列油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)，使通過分子手段設(shè)計和改造作物株型與生育期成為可能。雖

4、然油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因在多種物種中的研究取得了突破性進展，但大豆中的研究卻非常有限。本研究是首次在大豆中克隆獲得油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因GmBRI1和GmCPD，其在株型構(gòu)建和開花時間調(diào)節(jié)方面的重要功能為通過分子操作調(diào)控株型和花期性狀，培育高產(chǎn)大豆品種創(chuàng)造了條件。本實驗對油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因GmBRI1和GmCPD進行了克隆及功能驗證，并對其與擬南芥和大豆開花的關(guān)系和在GmFT2a轉(zhuǎn)基因植株中的表達進行了探討，主要實驗結(jié)果如下：1.在大豆中克隆得到油菜素內(nèi)酯受體蛋白基因GmBRI1并進行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其與其他物種

5、來源的BRIs有較高的序列同源性和較近的親緣關(guān)系。GmBRI1與AtBRI1在序列和結(jié)構(gòu)域上都有很強的保守性，且蛋白三級結(jié)構(gòu)極端相似，預(yù)示二者可能具有相似的功能。將GmBRI1基因轉(zhuǎn)入油菜素內(nèi)酯不敏感突變體bri1-5中，突變體的極端矮化、葉片小而圓、根長縮短、果莢瘦小的表型被GmBRI1基因的表達恢復(fù)至野生型狀態(tài)。且通過光暗下胚軸伸長實驗、BR根長抑制試驗和BR標(biāo)簽基因的表達檢測實驗確認了GmBRI1基因?qū)ri1-5突變體表型的恢復(fù)是因為修復(fù)了突變體內(nèi)部受損的BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。從而確認我們克隆得到的GmBR

6、I1基因是有功能的，且與AtBRI1基因功能相似。I2.在大豆中克隆得到了4個油菜素內(nèi)酯P450單加氧合成酶基因GmCPD1、GmCPD2、GmCPD3和GmCPD4。同源序列比對和進化樹分析顯示，4個GmCPD與其他CPD基因在序列上同源性較高且具有同一起源。4個GmCPD與AtCPD在序列上有較高的同源性，尤其四個特征結(jié)構(gòu)域的序列非常保守，表明二者在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度保守的特性。將4個GmCPD基因分別轉(zhuǎn)入油菜素內(nèi)酯合成突變體cpd-91中都能恢復(fù)后者的表型：葉片變?yōu)殚L圓形、株高顯著增加、果莢變大、根系更

7、加發(fā)達，與野生型的表型接近。在光暗下胚軸伸長實驗、BR根長抑制實驗和對根發(fā)育與開花時間的分析中發(fā)現(xiàn)，4個GmCPD基因的表達都能夠修復(fù)突變體BR合成路徑，恢復(fù)內(nèi)源BR的水平。且在植株形態(tài)建成，根發(fā)育和葉片形態(tài)的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。3.對GmBRI1和4個GmCPD基因在大豆不同組織中的表達情況進行了分析，發(fā)現(xiàn)GmBRI1基因主要在下胚軸和子葉這些細胞生長和分裂旺盛的部位表達；GmCPD1、GmCPD3和GmCPD4基因主要在大豆子葉和葉片中表達；GmCPD2基因在各組織表達量都較低，主要在幼嫩果莢中表達。對大豆

8、外源施加BR后，GmBRI1和4個GmCPD基因都有快速而強烈的響應(yīng)；處理后GmBRI1基因表達上調(diào)而4個GmCPD基因都表達下調(diào)。4.對油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因與植物開花的關(guān)系進行了探索。CPD缺失突變體開花延遲的現(xiàn)象在本實驗中也得到了證實，而GmCPD基因在cpd突變體中的表達能夠恢復(fù)后者的晚花表型，表明CPD基因在開花過程中必不可少。在大豆開花逆轉(zhuǎn)系統(tǒng)中，大豆自貢冬豆品種短日誘導(dǎo)13天