hep介導禽致病性大腸桿菌ce129病原性的研究

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1、'3風舖心芝;彎鍵苗攀¥,.:.^斯'巧r^濟許藻袁./矣A,-寺辦t游.0於:‘方鼻據(jù)叫大聲;#YANGZHOUUNIVERSITY.",分、.、<*^"一*:一.讀"參^碩去學住冷丈,,;;:心糸’’‘若;^無(學術(shù)型)''巧'He介導禽致病性大腸桿菌129病原性的硏究<p^^-、-形柳.j.*廬卷■’一-‘I...*?辛-<v^^225009■A:江蘇額州:指導教師姓名朱國強教授,揚州大學,,、^-、...去學科專業(yè)名稱申請學位級別;碩:墊度

2、蓋堅i__勺20?15年6論文提交日期:2015年4月論文答辯日期:月'、學仿暢予草仿-;揚州大學學位授予日期:2015年6月:,‘六、、答辯委員會主席:郭愛珍教授.乂.戶^—識、滿-卷也>舞y.讀杉起難少辦省心二V乂乂心苗誇寒友;瑣V.接辦警...'.汾海.片軒攝茲.>/.令,—二立占令^Hep介導禽致病性大腸桿菌化129病原性的硏究StudyonHepmediatedAPECCE129pathogenicity研究生:張琪導師:朱國強教授揚州大學畜禽

3、病原微生物實驗室2015年6月I張與Hep介導舍致病性大腸巧菌CE129瘤原性的巧究Hep介導禽致病性大腸桿菌化129病原性的研究中文摘要v一禽大腸桿菌病(AianColibacillosis)是養(yǎng)禽業(yè)最嚴重的傳染病之,給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失ianPathoenic化,至今尚無有效的防治措施。禽致病性大腸桿茜(AvgAPEC)分離株眾多,其詳細致病機理還有待深入研究,但是已經(jīng)證實眾多的毒力基因是m一其主要致病因子I型分泌系統(tǒng)(teVIsecretionssteT6SS)是,。Vypy,

4、種新型分泌系統(tǒng)HeI^Hqp管道是其主要結(jié)構(gòu),在細菌致病過程中扮演重要角色。本研究j主要亞單位Awj和Aep;基因為切入點,探討其在APECCE129菌株感染宿主過程中的病原性。試驗通過比對NCBI上;2巧/、知?^基因的已知序列,利用隆菌體Red同源重組系統(tǒng);對禽致病性大腸桿菌(APEC)野生株CE129的VI型分泌系統(tǒng)(T6SS)&巧/和A巧2基困一沁和基因進行敲除對引物用于檢測實驗菌株APECCE1巧是否含有,。首先各設(shè)計’引物分別與GeneBank中已知的的9/和Ac/72基因序列5端同源。然后根據(jù)試驗菌株的的!

5、7/’’一Ac和沁72基因再各設(shè)計對引物,其5端分別與/和A巧2基因序列兩側(cè)同源,而3端則/f與質(zhì)粒pKD3的氯霉素抗性基因同源,用于獲得帶氯霉素抗性基因的PC民產(chǎn)物,純化后導入含有質(zhì)粒pKD46的APECCE129菌株中,在Red重組酶Beta、Exo、Gam作用下,氯霉素抗性基因片段依靠兩側(cè)同源序列與細菌染色體的範基因發(fā)生重組,將Aep/和一基因置換下來,通過氯霉素抗性平板篩選獲得陽性克隆,即完成次重組。再電轉(zhuǎn)化導入編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20,通過對C誠兩側(cè)Flp位點的識別,消除抗性基因,即完成二次重組。最

6、后通過PCR特異性檢測和測序結(jié)果,驗證缺失株CE1巧巧/、CE129加巧2和的成功構(gòu)建。體外競爭試驗結(jié)果表明,缺失株在與野生株的競爭中處于微弱劣勢,相比,,其毒力被輕度弱化。血清殺菌試驗結(jié)果顯示野生株CE129缺失株畑129如巧/、CE12921/2CP2、CE129^iAwM/呼2巧抗血清補體殺菌的能力分別下降32.7%、化1%和50.6%(只<0.01)。生物膜定性定量試驗結(jié)果表明,處C於缺失株形成生物膜能力下降40%(?<0.01),回補株上升至87%dDF1細胞熟附試驗結(jié)果表明,-dAc於缺失/<株的熟附能力下降

7、46%(;70.01),回補誅上升至96%。雞化體內(nèi)感染試驗結(jié)果顯示,苗Ac護和單缺失株在雞巧體內(nèi)的増殖水平約為野生株的Vs,雙缺失株約為野生1株的/2。RealTimePCR定量試驗結(jié)果顯示,Ac;?/和的?。罚不蚓哂袇f(xié)同表達關(guān)系;相比野生株CE129,缺失株CE12921&巧;對群體感應/wxS、似成、/訴基因表達量分別下降29%、II揚州大學碩壬學位論文41%、33%(;?<0.05),Acp/回補株分別上升至85%、%%、%%,對抗血清存活因子0W如和m基因表達量分別下調(diào)29%和24%(p<0

8、.05),回補株分別上升至109%和105%;缺失株沈口9如對菌毛抑7^基因表達量下調(diào)47%(7<0.01),知補株上升至88%,

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