非洲豬瘟病毒膠體金免疫層析試紙條的研制

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1、分類號學(xué)號ＭＺ１２５０３ＵＤＣ密級緩？義聲叫ＹＡＮＧＺＨＯＵＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＩＪ碩擊學(xué)佐冷文業(yè)型（專）非洲豬瘍病毒膠體金免疫層析試紙條的研制吳海濤＇大學(xué)江蘇揚州，２２５００９指導(dǎo)教師姓名：成大榮教授，損州，？碩去學(xué)科專業(yè)名稱巧請舉仿級別：；獸醫(yī)碩去論文提交日期：２０１５年４月論文答辯日期：２０１５年６月學(xué)位授予單位：揚州大學(xué)學(xué)位授予日期：２０１５年６月答辯委員會主席：郭愛珍教授２０１５年６月非洲豬痘病毒膠體金免疫層析試紙條的研制Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏ

2、ｆｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｓｔｒｉｐｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｍｓ研究生；吳海濤導(dǎo)師；成大榮教授專業(yè)；獸醫(yī)碩±ＹａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙＪｕｎｅ２０１５吳海濤：非洲豬遍病毒膠體金免疫層析試紙條的研制１＿中文摘要非洲豬搖（Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ，ＡＳＦ）是由非洲豬痘病毒（Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ，一ＡＳＦＶ）引起的豬的種急性、烈性、高度接觸性傳染性疾病。其臨床特征主要

3、為全身出血、呼吸障礙巧神經(jīng)癥狀，發(fā)病率和死亡率高，對養(yǎng)豬業(yè)的危害巨大。且目前尚無有效的疫苗用于該病的預(yù)防，主要通過檢疫后撲殺來控制其爆發(fā)和流行。因此，建立科學(xué)有效的檢測診斷方法對于非洲豬癌的防范具有重要意義。為獲得ＡＳＦＶＰ７２融合蛋白ＥＴ－３０ａ－７２，本研究利用前期研充中構(gòu)建的重組菌株ｐＰ＞（ＢＬ２１）接種到ＬＢ液體培養(yǎng)基，ＷＩＰＴＧ進行誘導(dǎo)后，收集菌體并レッ超聲波進行裂解，裂－證明了該Ｐ７２融合蛋白可Ｗ在大腸桿菌ＢＬ２解物經(jīng)ＳＤＳＰＡＧＥ分析，１中大量表達。通過免疫印記技術(shù)分析可知，該融合蛋白可Ｗ與鼠抗Ｈｉｓ

4、標(biāo)簽單抗特異性反應(yīng)，將表達的Ｐ７２重組蛋白經(jīng)Ｈｉｓ標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化后免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。復(fù)蘇本實驗室保存的抗ＡＳＦＶ的雜交瘤細胞株２Ｄ３，擴大培養(yǎng)后接種于１０周齡Ｗ上經(jīng)產(chǎn)ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，采用體內(nèi)腹水誘生法制備了含有抗ＡＳＦＶ單抗的腹水。Ｖ抗體分別經(jīng)飽和一將收集的ＡＳＦ硫酸錢法、辛酸硫酸較聯(lián)合沉淀法、ｐｒｏｔｅ虹Ｇ柱－親和層析法進行純化，對純化后的抗體經(jīng)ＳＤＳＰＡＧＥ比較分析，最終選擇純化效果較好的ｐｒｏｔｅｉｎＧ柱親和層析法。純化后的抗體經(jīng)紫外分光光度儀測定濃度，并用已建立的間接ＥＬＩＳＡ法測定其

5、效價，單抗為１：１６００００，多抗為１：５１２００。為制備ＡＳＦＶ膠體金免疫層析試紙條，研究中采用直徑為３０ｎｍ的膠體金顆粒標(biāo)記純化后的單抗２Ｄ３作為金標(biāo)抗體，Ｗ純化后的多抗固定于ＮＣ膜上作為檢測線，其最佳．４７ｍ／ｍ＾將葡萄球菌Ａ蛋白（ＳＰＡ）固定于ＮＣ膜上作為質(zhì)控線濃度為１ｇ，其最佳濃度為ｍＬ。－１．０ｍｇ／，組裝成用于檢測ＡＳＦＶ的膠體金免疫層析試紙條ｐＥＴ３０ａ和－ＰＧＥＸ－６Ｐ１為載體表達的ＡＳＦＶＰ７２蛋白（簡稱Ｐ３Ｐ蛋白和ＰＸＰ蛋白）作為陽性樣晶，ＰＢＳ緩沖液、生理鹽水、蒸饋水等作為陰性樣品來檢測試紙

6、條。結(jié)果顯示陽性樣品有明顯的兩個條帶一且試紙條能檢測到的Ｐ，而陰性樣品只顯示個條帶，３Ｐ蛋白和ＰＸＰ蛋白的最低濃度分別為４５ｉｉ／ｎｉＬ和６０ｎ／ｍＬ。ｇｇ關(guān)鍵詞：非洲豬痘病毒；免疫；；抗體；免疫金層析試紙條２揚州大學(xué)碩±學(xué)位論文ＡｂｓｔｒａｃｔＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒＡＳＦｉｓａｎａｃｕｔｅｖｉｒｕｌｅｎｔｈｉｈｌｃｏｎｔａｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｏｆｄｏｍｅｓｔｉｃｉｓ（），，ｇｙｇｐｇｃａｕｓｅｄｂＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒａｓＡＳＦＶ．Ｔｈｅｍａｉｎ

7、ｃｌｉｎｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｓｏｆＡＳＦｉｎｃｌｕｄｅｙ（）ｓｙｓｔｅｍｉｃｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ，ＫＳｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｏｒｄ鄭ｓ，ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍｓ，ｈｉｇｈｉｎｃｉｄｅｎｃｅｒａｔｅａｎｄｄｅａｔｈｒａｔｅ．ＡＳＦｉｓｓｅｒｉｏｕｓｌｙｔｈｒｅａｔｅｎｉ凸ｇ化ｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｉｇｗｉｔｈｎｏｅｆｅｃｔｉｖｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄＳｏｉｔｉｓｖｅｒｉｍｏｒｔａｎ化ｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｅｆｅｃｔｉｖｅｔ

8、ｅｃｈｎｏｌｏ１：０ｄｅｔｅｃｔｔｈｉｓｄｉｓｅａｓｅ．．ｔｙｐｇｙ＊Ｉｎ－－ｔｈｉｓｉｅｓｅａｒｃｈｉｒｅｃｏｍｂｉ