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1、非酯化脂肪酸誘導牛皺胃平滑肌細胞死亡的機制研究Themolecularmechanismsofcelldeathinducedbynon-esterifiedfattyacidinbovineabomasalsmoothmusclecell作者姓名：魏騰專業(yè)名稱：臨床獸醫(yī)學指導教師：謝光洪副教授學位類別：農學碩士答辯日期：2015年6月5日本研究受“國家自然科學基金”項目資助(項目編號：31101865)ThisstudywassupportedbytheNaturalScienceFoundationofChina(Grantnos
2、.31101865)中文摘要非酯化脂肪酸誘導牛皺胃平滑肌細胞死亡的機制研究奶牛皺胃變位(displacedabomasum,DA)是臨床上常見的內科疾病，該病通常發(fā)生于圍產期奶牛。近年來，隨著現(xiàn)代奶牛業(yè)工業(yè)化和集約化發(fā)展，飼養(yǎng)規(guī)模的迅速擴大，皺胃變位發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢。該病已受到業(yè)內人士的高度關注，其病因和發(fā)病機理是目前的研究熱點。目前研究認為皺胃遲緩和擴張是皺胃變位發(fā)生的病理學基礎。同時，流行病學調查指出皺胃變位的奶牛通常伴有血液中高濃度的非酯化脂肪酸(non-esterifiedfattyacid,NEFA)和β-羥丁酸，提示NE
3、FA和β-羥丁酸與皺胃變位的發(fā)生有相關性。本研究以原代培養(yǎng)的牛皺胃平滑肌細胞（bovineabomasumsmoothmusclecell,BSMC）為研究對象，觀察生理濃度和病理濃度下的NEFA對BSMC細胞活力、氧化應激、細胞凋亡等方面的影響，并進一步探究潛在的機制。MTT實驗結果顯示，0.1~0.9mmol/L的NEFA對BSMC細胞活力無負面影響，而1.2-3.3mmol/L的NEFA處理后，細胞活力顯著下降。三個處理時間點（12小時、24小時、48小時）1.2-3.3mmol/L的NEFA都能使細胞活力明顯減少。接下來，我們
4、進行了細胞凋亡分析，發(fā)現(xiàn)0.6mmol/L的NEFA對細胞凋亡率無顯著影響，而1.2mmol/L和1.8mmol/L的NEFA處理后，細胞凋亡率顯著增高，進一步確認了NEFA對BSMC的細胞毒性。為了探索NEFA引起的BSMC細胞死亡是否通過氧化應激途徑，我們檢測了若干個細胞內氧化指標和抗氧化指標，包括使用DCFH-DA熒光探針檢測胞內活性氧水平，生物化學試劑盒檢測抗氧化酶（超氧化物歧化酶和過氧化氫酶）的活力，以及丙二醛、谷胱甘肽的含量。實驗結果顯示1.2mmol/L和1.8mmol/L的NEFA有效地降低了細胞抗氧化能力而促進了氧化
5、因子的增高，說明NEFA引起B(yǎng)SMC細胞氧化應激。而后，我們研究了NEFA引起B(yǎng)SMC細胞凋亡的機制。通常認為，氧化應激介導的細胞凋亡是通過激活線粒體凋亡途徑。因此，我們檢測了線粒體凋亡通路的相關因子：線粒體膜電位的變化（Rhodamine123探針），細胞色素C的分布（Westernblot），凋亡蛋白caspase-9、caspase-3、PARP的激活（Westernblot），I促/抑凋亡蛋白Bax/Bcl-2的表達（Westernblot），以及凋亡蛋白AIF的入核（免疫熒光法）。實驗結果顯示1.2mmol/L和1.8mmo
6、l/L的NEFA顯著地引起了線粒體膜電位的下降，細胞色素C的釋放，caspase-9、caspase-3、PARP的激活，Bax表達增加，Bcl-2表達減少，AIF入核，說明NEFA激活了線粒體凋亡途徑。綜合上述實驗結果，可以確認1.2mmol/L和1.8mmol/L的NEFA顯著地引起了細胞活力的降低和細胞凋亡率的增高，胞內抗氧化能力的下降和活性氧、丙二醛含量的升高，以及凋亡蛋白的激活。此外，在添加抗氧化劑NAC預處理后，NEFA引起的上述事件均得到了有效地抑制，進一步確認了NEFA是通過氧化應激介導的細胞凋亡機制。本研究探討了NE
7、FA對皺胃平滑肌細胞氧化應激的影響，為加深對NEFA生理作用的認識提供理論依據(jù)，同時為闡明DA的發(fā)病機理和防治提供新的思路。關鍵詞：非酯化脂肪酸；牛皺胃平滑肌細胞；氧化應激；細胞凋亡。IIABSTRACTThemolecularmechanismsofcelldeathinducedbynon-esterifiedfattyacidinbovineabomasalsmoothmusclecellDisplacedabomasum(DA)isatypicalgastricdisorderdisease,whichfrequentlyoc
8、curredinhigh-yieldingdairycows.Recently,withtherapiddevelopmentofdairyfarming,theincidenceofDAhasbeenrising.Du
