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《犬狂犬病抗體直接競爭elisa檢測方法的建立及初步應(yīng)用》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、犬狂犬病抗體直接競爭ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用Development&PreliminaryApplicationofDirectCompetitiveELISAforMonitoringRabiesAntibodyinCanine作者姓名：任嚴新領(lǐng)域（方向）：獸醫(yī)指導教師：張茂林副教授類別：獸醫(yī)碩士答辯日期：2015年6月2日本研究由國家自然科學基金（項目編號：31272579）資助ThisresearchwassupportedbytheGrantsNo.31272579fromNationalNaturalScienceFoundationofC
2、hina.摘要狂犬病是由彈狀病毒科、狂犬病病毒屬的狂犬病病毒（RABV）引起的一種人獸共患病毒病，患病動物和人常出現(xiàn)嚴重的腦脊髓炎癥狀，一旦發(fā)病，死亡率接近100%。全世界每年因感染狂犬病死亡的人數(shù)約6萬人，其中絕大部分發(fā)生在非洲和亞洲?？袢〉淖匀凰拗鞣秶軓V，幾乎所有的溫血動物均可感染此病。犬是我國狂犬病毒最主要的貯藏宿主和傳播媒介，95%以上的人狂犬病是通過患病犬咬傷或者舔舐破損皮膚而引起。世界衛(wèi)生組織（WHO）和世界動物衛(wèi)生組織（OIE）認為體內(nèi)中和抗體水平≥0.5IU/mL時，機體能抵抗該病的感染。動物免疫覆蓋率達到70%時，可有效控制狂犬病的傳播。
3、因此在狂犬病控制過程中，通過提高犬狂犬疫苗免疫覆蓋率并結(jié)合抗體監(jiān)測，可有效防止免疫失敗及漏免現(xiàn)象，這對于控制我國狂犬病的流行傳播有著十分重要的意義。目前WHO和OIE推薦的中和抗體檢測方法分別為快速熒光灶抑制試驗（RFFIT）和熒光抗體病毒中和試驗（FAVN）。雖然這兩種方法能夠?qū)w內(nèi)中和抗體準確定量，但都需要操作強毒和細胞，還需一定的儀器設(shè)備，對血清的質(zhì)量要求也較高，且試驗周期較長，不適于大規(guī)模的樣品檢測。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）通過酶催化底物的顏色變化來指示抗原抗體反應(yīng)，不僅可以避免上述兩種方法的弊端，而且可以實現(xiàn)對樣品的大批量快速檢測。辣根過氧化物
4、酶（HRP）因其分子量小，對化學修飾的穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，成為ELISA中最常用的標記酶。本試驗擬通過硫酸銨沉淀和ProteinA親和層析法提取犬高免血清中的抗狂犬病毒IgG抗體，并經(jīng)PAGE電泳鑒定純度后，采用過碘酸鈉氧化法標記HRP，將此酶標抗體作為競爭抗體，采用直接競爭ELISA法（c-ELISA）測定血清樣品中的抗體效價，以此來避免間接ELISA法在大規(guī)?？贵w檢測中存在的非特異性。犬抗狂犬病病毒IgG抗體純化。本實驗中，采用改進的硫酸銨沉淀法提取犬高免血清中抗狂犬病病毒IgG抗體，經(jīng)ProteinA親和層析法精純后，用SDS-PAGE和ELISA檢測純化抗
5、體的純度和活性。經(jīng)檢測，硫酸銨沉淀純化后的抗體回收率為96%，抗體效價約為82923×10，ProteinA親和層析的抗體效價約為3×10。純化抗體的HRP標記及其工作濃度篩選。應(yīng)用過碘酸鈉氧化法將HRP標記到純化IgG上，經(jīng)45%硫酸銨沉淀收獲酶標記抗體。經(jīng)紫外分光光度法檢測發(fā)現(xiàn)，酶標抗體中的酶結(jié)合率為39%。通過方陣法確定的ELISA最適反應(yīng)條件為：最佳抗原包被濃度為50μg/mL，酶標抗體最佳稀釋度為1:1000。應(yīng)用犬易感的幾種病原包被，發(fā)現(xiàn)所制酶標抗體與它們均無I交叉反應(yīng)性。ELISA檢測抗體標準曲線的建立。將標準陽性血清二倍倍比稀釋后，采用c-EL
6、ISA法測血清抗體效價和吸光度標準曲線，得到的線性回歸方程為Y=－6.387X＋5.617，決定系數(shù)2為R=0.940。確定該方法的敏感度為0.25IU/mL，檢測范圍為0.25-4IU/mL。采用該方法測定血清樣品中抗體滴度，并與FAVN法對比，發(fā)現(xiàn)兩者所得結(jié)果無顯著性差異（P=0.092，P＞0.05）。精密性檢測發(fā)現(xiàn)，平均板內(nèi)變異系數(shù)為4.76%，平均板間變異系數(shù)為5.89%。關(guān)鍵詞：狂犬病，IgG，抗體檢測，辣根過氧化物酶，直接競爭ELISAIIAbstractRabiesvirus（RABV）isthetypicalmemberofthezoonot
7、icviruses,belongingtogenusLyssavirusoffamilyRhabdoviridaewhichisresponsibleforfatalencephalitisinanimalsandhumans.Oncethesymptomsstartappearing,themortalityrateisalmost100%.Over60,000humandeathsoccurglobally,mostofwhichinAfricaandAsia.Almostallwarm-bloodedanimalscanbeinfectedbyrabie
8、svirus.However,stra
