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1、密級(jí):論文編號(hào):中囯農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文豬圓環(huán)病毒2型與豬鼻支原體共感染協(xié)同致病性研究StudiesonSynergeticPathogenicityofCo-infectionwithPorcineCircovirusType2andMycoplasmahyorhinis碩士研宄生：陳冬杰指導(dǎo)教師：劉長(zhǎng)明研宄員申請(qǐng)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)：彌騰E學(xué)研宄方向：善固培養(yǎng)單位：哈爾濱獸醫(yī)研宄所研宄生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationStudieson
2、SynergeticPathogenicityofCo-infectionwithPorcineCircovirusType2andMycoplasmahyorhinisM.S.Candidate:ChenDongjieSupervisor:Prof.LiuChangmingMajor:PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:VeterinaryMicrobiologyandMolecularBiologyMay2015III摘要豬圓環(huán)病毒2型（Porcinecircovirus2，PCV2）是引起豬圓環(huán)
3、病毒相關(guān)疾?。≒orcinecircovirus-associateddisease，PCVAD）的重要病原，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬鼻支原體（Mycoplasmahyorhinis，Mhr）能夠感染不同年齡的豬，引起胸膜炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎、中耳炎、多發(fā)性漿膜炎及豬地方性肺炎（Swineenzooticpneumoniae，SEP），嚴(yán)重影響豬只生長(zhǎng)性能。該病原體在臨床上常與PCV2、PRRSV等病原體混合感染，致使斷奶仔豬的死亡率顯著升高。目前Mhr和PCV2的共感染特性及其感染機(jī)制尚不清楚，闡明這兩種病原體協(xié)同感染對(duì)仔豬的致
4、病性具有重要的臨床意義。本研究通過(guò)建立Mhr核酸、抗原和抗體等的檢測(cè)方法，利用實(shí)驗(yàn)室分離的Mhr（DL株）與PCV2（PCV2b，YJ株）進(jìn)行了共感染試驗(yàn)，旨在闡明這兩種病原體共感染對(duì)仔豬的致病性作用。第一、豬鼻支原體抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用。為了檢測(cè)豬血清中Mhr抗體水平，本研究采用脫氧膽酸鈉法（DOC）提取Mhr膜蛋白作為包被抗原，建立了用于Mhr血清抗體檢測(cè)的間接ELISA方法。其特異性為90.5%，敏感性為98.0%。除豬肺炎支原體（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhyo）外，該方法與幾種豬病毒陽(yáng)性血
5、清及副豬嗜血桿菌IV型陽(yáng)性參考血清均無(wú)交叉反應(yīng)。對(duì)Mhr-DL菌株感染巴馬豬血清抗體檢測(cè)表明，Mhr感染后第3d血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，第35d時(shí)抗體達(dá)到高峰，抗體效價(jià)為1:6400。用該方法與IDEXX肺炎支原體抗體檢測(cè)試劑盒平行檢測(cè)138份現(xiàn)地血清樣品，Mhr和Mhp陽(yáng)性檢出率分別為71.0%和44.9%。對(duì)來(lái)自黑龍江、吉林、山東等地臨床送檢的457份血清檢測(cè)結(jié)果顯示，Mhr陽(yáng)性率為70.3%，表明我國(guó)養(yǎng)豬群Mhr感染十分普遍。第二、抗Mhr膜蛋白的單克隆抗體制備及抗原表位的鑒定。本研究以DOC提取的Mhr膜蛋白免疫BALB/c小鼠，并通過(guò)淋巴細(xì)
6、胞雜交瘤技術(shù)獲得了10株能夠穩(wěn)定分泌特異性抗DOC提取膜蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，依次命名為1B4、1D2、1H8、1H12、2B6、2H2、3G2、3G10、4B7和4H2；MAb亞類鑒定除2H2為IgG2b亞型外均為IgG1亞型，輕鏈均為κ鏈；雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液55上清效價(jià)為1:200～1:400，腹水效價(jià)為1:1.0×10～1:2.0×10；Westernblot結(jié)果顯示，其中5株單克隆抗體針對(duì)Mhr同一種大小膜蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)。經(jīng)質(zhì)譜分析、蛋白表達(dá)和Westernblot鑒定該膜蛋白為Mhr丙酮酸脫氫酶E1復(fù)合體α亞基。為了對(duì)其抗原表位進(jìn)
7、行鑒定，通過(guò)對(duì)Mhr丙酮酸脫氫酶E1復(fù)合體α亞基截短表達(dá)與人工合成肽相結(jié)合的方法對(duì)其表位進(jìn)一步分析，初步269283299313確定了3個(gè)抗原表位，分別為SSDNPRIYRTEEEEK，KDKKYITDEEIKQIW和350360LKEQKQHAKDY。第三、Mhr核酸檢測(cè)SYBR熒光定量PCR方法的建立及其應(yīng)用。為了檢測(cè)豬血液及組織中Mhr核酸載量，本研究參考GenBank發(fā)表的MhrP37基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，建立了一種能夠檢測(cè)Mhr核酸載量的特異性好、敏感性高的SYBR熒光定量PCR方法。該方法擴(kuò)增效率為1.04，誤差值為0.0
8、189，批內(nèi)變異系數(shù)小于2.0%。與常規(guī)PCR相比，本方法敏感性提高100倍以上。該方法與豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、PCV2、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬
