豬圓環(huán)病毒2型cap蛋白原核表達(dá)及間接elisa方法的建立

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3、瓣Ｉ翻謙闊Ｉ，補(bǔ)參謂，．．ｍ．－；點(diǎn)Ｖ纖；馨聲華養(yǎng)學(xué)校代碼１０２２５：學(xué)號：Ｓ１５５１８學(xué)化冷文豬圓環(huán)病毒２型Ｃａｐ蛋白原核表達(dá)及間接ＥＬＩＳ乂方法的建立楊堇聖指導(dǎo)教師姓名：田麗紅副教授東北林業(yè)大學(xué)申請學(xué)位級別：：碩±學(xué)科專業(yè)生理學(xué)論文提交日期：２０１５年４月論文答辯日期：２０１５年６月：２０１５授予學(xué)位單位：東北林業(yè)大學(xué)授予學(xué)位日期年６月答辯委員會主席：白秀娟教授論文評閱人：、＃４《并：乂爭ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＣｏｄｅ：１０２２５

4、ＲｅｇｉｓｔｅｒＣｏｄｅ：Ｓ１５５１８ＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅＤｅｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｇＰｒｏｋａｒｏｔｉｃＥｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＣＶ２ＣａｒｏｔｅｉｎａｎｄｙｐｐｐｔｈｅｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔａｎｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡｐＣａｎｄｉｄａｔｅ：ＹａｎＹｉｎｉｎｇｇｙｇＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：ＴｉａｎＬ化ｏｎｇＡｓｓｏｃｉａ化Ｓｕｐｅｒｖｉｓｏｒ：ＡｃａｄｅｍｉｃＤｅｒｅｅＡｌｉｅｄｆｏｒ：ＭａｓｔｅｒｇｐｐＳｐｅｃ

5、ｉａｌｉｔｙ：ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙＤａｔ：ｅｏｆＯｒａｌＥｘａｍｍａｔｉｏｎ：Ｊｕｎｅ２０１５，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ：ＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒｅｓｔｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｙｙ摘要摘要豬圓環(huán)病毒２型（Ｐｏｒｃｉｎｅｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｔｅ２ＰＣＶ２）被公認(rèn)為在世界范圍養(yǎng)豬業(yè)中造ｙｐ，一成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)影響的最重要的病毒之。由于病毒、宿主的免疫力、混合感染情況和其他（ｏｒｃｉｎｅｃｉｖｉｍ環(huán)境特征的差異，ＰＣＶ２能引起不同的疾病，統(tǒng)稱為圓環(huán)病毒?。穑颍悖铮螅崳姡湟灰唬椋螅澹幔螅?/p>

6、ｓＰＣＶＤｓ）。我國是ＰＣＶＤｓ在我國直呈上升趨勢，給我國的養(yǎng)，個養(yǎng)豬大國，豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。血清抗體的檢測常被用來分析ＰＣＶ２的感染情況Ｗ及評價疫苗的免疫效果。ＥＬＩＳＡ因其敏感、特異、檢測快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用。然而研究表明，國內(nèi)檢測ＰＣＶ２抗體的ＥＬＩＳＡ試劑盒普遍存在敏感性偏低的問題，而進(jìn)口試一。，、劑盒因其價格昂貴，難于普及應(yīng)用因此建立種快速簡便、敏感、特異的診斷方法對于ＰＣＶ２的預(yù)防和控制具有重要意義。－－本研究利用ＰＣＲ方法擴(kuò)增ＰＣＶ２０ＲＦ２全長基因，構(gòu)

7、建原核表達(dá)載體ｐＥＴ３０ａ’Ｃｃｏ－ａｐ，轉(zhuǎn)化￡；／！ＢＬ２１ＤＥ３。在ＳＤＳＰＡＧＥ分析基礎(chǔ)上，結(jié)合ＩｍａｅＪ和Ｇｒａｈａｄ（）ｇｐｐｒｉｓｍ５０軟Ｃａ，０〇ＩＰＴＧｐ．件的分化對影響重組ｐ蛋白表運(yùn)的誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)起始６〇〇，￣濃度及誘導(dǎo)時間等因素進(jìn)行了優(yōu)化：．０１．，確定最佳表達(dá)條件為當(dāng)菌體濃度達(dá)到１５‘時，加入終濃度為０．２ｍＭ的ＩＰＴＧ，巧Ｃ恒溫?fù)u床１７５ｒｐｍ振蕩培養(yǎng)５ｈ。為得到高純度的重組Ｃａｐ蛋白，對重沮Ｃａｐ蛋白純化條件進(jìn)行了探索，確定蛋白洗緣液中咪性濃度

8、為１００ｉｎＭ，蛋白洗脫液中瞇嗤濃度為３００ｍＭ。純化后的蛋白進(jìn)斤Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鑒定，－重組Ｃａｐ蛋白只與ＰＣＶ２標(biāo)準(zhǔn)陽性血清反應(yīng)，與ＢＬ２１ＤＥ巧陽性血清和ＥＴ３０ａ／（ｐ化２１（ＤＥ３）陽性血清均不發(fā)生反應(yīng)，表明純化的重姐Ｃａｐ蛋白具有良好的特異性和反應(yīng)原性。純化的重沮Ｃａ－蛋白為包被抗原，２ＣａＥＬＩＳＡ檢測ｐ，優(yōu)化