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《活化的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、活化的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化ActivatedmacrophageinducesEpithelial-MesenchymalTransitionofrenaltubularepithelialcell作者姓名：杜偉專業(yè)名稱：病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：吳珊教授學(xué)位類別：醫(yī)學(xué)碩士答辯日期：2015年5月21日中文摘要活化的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化終末期腎臟疾病最為理想及有效的治療方法是腎移植。近年來，腎移植短期存活率有了明顯提高，而腎移植遠(yuǎn)期存活率仍然不容樂觀，移植腎慢性腎功能的喪失最終表現(xiàn)為腎纖維化。腎纖維化
2、的主要病理學(xué)特征是腎小管萎縮同時(shí)伴有間質(zhì)纖維組織增生。間質(zhì)纖維組織大量累積是由肌成纖維細(xì)胞活化增生引起的，肌成纖維細(xì)胞的來源有多個(gè)學(xué)說，目前研究認(rèn)為肌成纖維細(xì)胞的一個(gè)重要來源是腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，即Epithelial-MesenchymalTransition（EMT）。有實(shí)驗(yàn)表明，T淋巴細(xì)胞可以直接破壞腎小管基膜，表現(xiàn)為“小管炎”，并且腎移植排斥時(shí)有大量淋巴細(xì)胞浸潤，因此以前人們都認(rèn)為主要是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)腎移植排斥反應(yīng)的發(fā)生。然而，有研究表明，腎移植排異中，間質(zhì)也有巨噬細(xì)胞浸潤，尤其是BanffⅠb及以上級(jí)別
3、的排異中間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤更多。基于以上研究，我們把目光集中在巨噬細(xì)胞上，研究巨噬細(xì)胞是否在腎小管上皮細(xì)胞的EMT過程中發(fā)揮重要作用。目的：本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖（LPS）體外激活鼠巨噬細(xì)胞株J774，然后用其培養(yǎng)上清誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞株NRK52E，觀察其能否促使NRK52E細(xì)胞發(fā)生EMT，并通過分析活化巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子成分，進(jìn)一步探討巨噬細(xì)胞在促進(jìn)EMT發(fā)生過程中的相關(guān)作用機(jī)制。方法：鼠巨噬細(xì)胞(J774)分別在含1μg/ml，1.5μg/ml，2.5μg/ml和5μg/ml脂多糖（LPS）的DMEM培養(yǎng)基中體外刺激
4、24小時(shí)和48小時(shí)，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的情況，并觀察用含2.5μg/mlLPS的DMEM培養(yǎng)基刺激24小時(shí)后J774的形態(tài)改變。將2.5μg/ml的LPS刺激24小時(shí)后的巨噬細(xì)胞消化離心，并用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞沉淀三次，收集第三次洗滌培養(yǎng)基做對(duì)照培養(yǎng)基。然后用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸巨噬細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，離心取上清做誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將NRK52E分為對(duì)照組和誘導(dǎo)組，對(duì)照組NRK52E的培養(yǎng)條件為對(duì)照培養(yǎng)基和DMEM按2:1混合后加
5、FBS使其最終濃度是5%，誘導(dǎo)組的培養(yǎng)條件I為誘導(dǎo)培養(yǎng)基和DMEM按2:1混合后加FBS使其最終濃度是5%。在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)48小時(shí)的對(duì)照組和誘導(dǎo)組NRK52E細(xì)胞，用Real-TimePCR、WesternBlot和免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測NRK52E細(xì)胞的上皮標(biāo)記物，如E-鈣粘蛋白（E-Ca），細(xì)胞角蛋白-19（CK19）和間充質(zhì)標(biāo)記物，如α-平滑肌動(dòng)蛋白（α-SMA），Vimentin。并采用ESI質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)檢測經(jīng)LPS（2.5μg/ml）激活24小時(shí)的巨噬細(xì)胞J774上清中分泌的細(xì)胞因子。結(jié)果：ELISA檢測結(jié)果表
6、明，未刺激組巨噬細(xì)胞J774用含LPS濃度為0的DMEM培養(yǎng)24小時(shí)或48小時(shí)后，J774培養(yǎng)上清中均未檢測到TNF-α和IL-6的存在。刺激組巨噬細(xì)胞J774用含1μg/ml，1.5μg/ml，2.5μg/ml和5μg/mlLPS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)或48小時(shí)后，J774培養(yǎng)上清中都檢測到有明確的TNF-α和IL-6分泌，表明不同濃度的LPS刺激J774作用24小時(shí)或48小時(shí)，都激活了J774巨噬細(xì)胞。但是用低濃度（1μg/ml）LPS刺激48小時(shí)與刺激24小時(shí)相比，J774上清中TNF-α和IL-6的含量都有下降，
7、因此我們在后續(xù)激活巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，選擇LPS的刺激時(shí)間是24小時(shí)。當(dāng)LPS濃度為2.5μg/ml，刺激巨噬細(xì)胞J774作用24小時(shí)后，J774培養(yǎng)上清中含有較高濃度的TNF-α和IL-6，因此綜合考慮，我們選擇LPS激活巨噬細(xì)胞的濃度為2.5μg/ml，刺激時(shí)間為24小時(shí)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，用LPS（2.5μg/ml）刺激J774作用24小時(shí)，倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)J774由圓形伸出偽足，煎蛋樣貼壁生長。以上結(jié)果表明，LPS在體外激活了J774細(xì)胞。分別在對(duì)照培養(yǎng)條件下和誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)NRK52E48小時(shí)后，與對(duì)照組相比，誘導(dǎo)組NR
8、K52E形態(tài)發(fā)生變化，由連接緊密的鋪路石樣上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為細(xì)胞間隙增大的長梭形間質(zhì)樣細(xì)胞。Real-TimePCR結(jié)果表明，與對(duì)照組細(xì)胞相比，誘導(dǎo)組NRK52E的上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK19的mRNA表達(dá)量降低，是對(duì)照組NRK52E的29%，而間充質(zhì)標(biāo)記物α-SMA的mRNA表達(dá)量上
