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1、分類號：密級：學號：2012108020單位代碼：10759石河子大學碩士學位論文牛支原體滅活疫苗的研制與免疫效果研究學位申請人楊銘偉指導教師剡根強（教授）申請學位門類級別農學碩士學科、專業(yè)名稱預防獸醫(yī)學研究方向動物傳染病診斷與防治所在學院動物科技學院中國·新疆·石河子2015年6月ResearchontheDevelopmentofMycoplasmabovisInactivatedVaccineandImmuneEffectincalvesADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfi
2、llmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByYangMing-wei(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.YanGen-qiangJune,2015摘要牛支原體（Mycoplasmabovis，M.bovis）是感染牛的一種重要的致病性病原體，主要引起牛的肺炎、乳腺炎和關節(jié)炎等多種疾病。美國于1961年首次從患乳腺炎的牛乳中分離得到該病原。國內于2008年首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離得到，此后在國內逐步蔓
3、延傳播，造成了巨大的經濟損失，為研發(fā)防控牛支原體病的有效疫苗，在綜合前期分析研究的基礎上，本文對牛支原體生長滴度測定、抗原菌懸液濃縮、滅活疫苗制備以及犢牛免疫效果評價等疫苗研發(fā)關鍵技術進行了試驗研究，主要研究內容及結果如下：1TTC應用于牛支原體活菌計數研究及牛支原體擴大培養(yǎng)效果測定為探討氯化三苯基四氮唑（TTC）應用于M.bovis菌落計數的可行性及實驗條件，通過平板計數法進行了TTC濃度篩選；采用傾注培養(yǎng)法對M.bovis擴大培養(yǎng)效果進行了菌落形成單位（Colonyformingunit，cfu）計數，通過顏色變化單位（Colourchangeun
4、it，ccu）法進行了濃度檢測，并測定了630nm處OD值及培養(yǎng)物pH的變化。結果：培養(yǎng)基中TTC質量濃度在0.3~0.6g/L時菌落正常生長且顯色效果明顯，TTC質量濃度較低時菌落顯色效果不明顯，較高時則會抑制M.bovis的生長，8TTC作用最佳質量濃度為0.4g/L；CFU法測得菌液濃度為1.8~2.42×10CFU/mL，CCU法測得牛支8原體菌株在96h時的生長滴度為5.0×10CCU/mL，兩種方法檢測結果基本一致；而不同時段牛支原體培養(yǎng)物OD值變化范圍在0.024~0.213，在對應時間點OD值與上述兩種方法未表現出一致性，OD值測定僅可
5、做為培養(yǎng)效果檢測時的輔助方法；培養(yǎng)物pH變化與OD值測定卻表現出一定的相關性。結果表明：TTC可應用于M.bovis活菌計數，菌落呈醒目紅色且特征明顯，可有效、準確地對M.bovis進行活菌計數；CFU法與CCU法均可應用于牛支原體擴大培養(yǎng)效果測定。2牛支原體生長曲線測定及不同培養(yǎng)基生長效果比較通過顏色變化單位法（Colourchangeunit，ccu）對牛支原體新疆分離株在牛支原體專用液體擴大培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)階段的生長滴度進行了測定并繪制了生長曲線，同時采用活菌計數法對牛支原體菌株在牛支原體專用液體擴大培養(yǎng)基、改良Thiaucourt’s培養(yǎng)基、牛
6、心湯培養(yǎng)基、葡萄糖血清肉湯培養(yǎng)基中的培養(yǎng)效果進行了比較。結果表明：活化培養(yǎng)后的牛支原體菌株在牛支原體專用液體擴大培養(yǎng)基中生長良好，該培養(yǎng)基相比其他三種培養(yǎng)基具有一定的經濟優(yōu)勢，可作為制備疫苗時牛支原體抗原獲取的最優(yōu)培養(yǎng)基。3牛支原體滅活疫苗的研制采用透析法、高速離心法及超濾濃縮法對M.bovis培養(yǎng)物進行了濃縮試驗對比研究，測定不同處理方法濃縮物蛋白含量，并利用CFU與CCU法測定了超濾濃縮后濃縮液濃度；應用ISA206雙相佐劑制備M.bovis滅活疫苗，先后進行了疫苗無菌檢測、物理性狀檢測、穩(wěn)定性與保存期試驗、動物安全性試驗，結果顯示超濾濃縮法處理得
7、到的濃縮物蛋白濃度最高，CFU法與CCU法檢測結果基本一致；所制備疫苗物理性狀良好，4℃可保存180d、37℃可存放3d，受試動物接種后未見異常反應，注射部位均正常，未見化膿及紅腫現象。結果表明：超濾濃縮法適用于M.bovis培養(yǎng)物I的濃縮，可用于疫苗生產時抗原的富集；疫苗安全可靠，為M.bovis滅活疫苗的規(guī)模化生產提供了一定的方法與技術支持。4牛支原體滅活疫苗免疫小鼠最小免疫劑量及抗體消長規(guī)律初步研究應用牛支原體滅活疫苗對小鼠進行最小免疫劑量及抗體消長規(guī)律初步研究。將制備的疫苗分別以0.1、0.2、0.3、0.4mL/只的不同劑量，經腿部肌肉途徑免
8、疫小鼠，結果顯示最小免疫劑量為0.2mL/只；以0.2mL/只劑量免疫小鼠，免疫3周后，抗體滴
