丹參EIL類轉(zhuǎn)錄因子EIN3基因的克隆與功能分析

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1、學(xué)校代碼：10270分類號：Q3學(xué)號：152200863碩士學(xué)位論文丹參EIL類轉(zhuǎn)錄因子EIN3基因的克隆與功能分析學(xué)院：生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院專業(yè)：遺傳學(xué)研究方向：藥用植物基因工程研究生姓名：王宇指導(dǎo)教師：開國銀教授完成日期：2018年5月ADissertationSubmittedtoShanghaiNormalUniversityfortheMaster’sDegreeCloningandFunctionalAnalysisofEILTranscriptionFactorGeneEIN3fromSalv

2、iamiltiorrhizaCandidate:YuWangSupervisor:ProfessorGuoyinKaiSpecialty:GeneticsDepartment:CollegeofLifeandEnvironmentScienceShanghaiNormalUniversityMay2018上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要摘要丹參是一種多年生草本植物，其根可入藥，丹參的主要活性成分包括脂溶性的丹參酮和水溶性的丹酚酸，丹參酮屬于二萜類，對抗菌消炎、抗腫瘤以及抗氧化有很好的促進作用；而丹酚酸B是目前

3、已知的抗氧化能力最強的天然產(chǎn)物之一；兩者均對心腦血管疾病有很好的療效。應(yīng)用前景廣泛和供求不足的矛盾使其成為代謝工程研究的一個熱點。根據(jù)AtEIN3在丹參轉(zhuǎn)錄組庫中本地blast得到一條全長為1797bp的轉(zhuǎn)錄因子，命名為SmEIN3。運用基因克隆、進化關(guān)系分析、時空表達模式分析、遺傳轉(zhuǎn)化及功能驗證、調(diào)控及互作關(guān)系對其功能初步探究，目前取得的結(jié)果如下：1、從丹參庫里找出一條全長為1797bp的SmEIN3，并將其克隆出來。2、通過系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)SmEIN3和SiEIN3親緣關(guān)系最相近，其次與SmEIL

4、1、AtEIN3和AtEIL1相近。3、組織表達譜分析表明，SmEIN3基因在葉中表達最高，其次是葉柄，最低的是主根和須根。分別用ABA、GA、SA、MJ、H2O、乙醇、YE、ET等誘導(dǎo)子處理之后，誘導(dǎo)表達譜分析發(fā)現(xiàn)SmEIN3響應(yīng)MJ和SA的誘導(dǎo)。在MJ和SA處理下，基因的表達量均在12h達到最高水平。4、利用瞬時煙草表達系統(tǒng)觀察SmEIN3的亞細胞定位。結(jié)果顯示SmEIN3蛋白定位在細胞核中。這與網(wǎng)站預(yù)測以及它作為轉(zhuǎn)錄因子的特點是相符合的。5、構(gòu)建SmEIN3過表達載體和抑制表達載體，轉(zhuǎn)化C58C1農(nóng)

5、桿菌感受態(tài)細胞，侵染丹參外植體，獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因毛轉(zhuǎn)根?；蚪MPCR鑒定得到11個過表達株系和3個抑制表達株系。qRT-PCR檢測丹參酮途徑關(guān)鍵酶基因，發(fā)現(xiàn)SmDXSII、SmCYP76AH1、SmDXR、SmKSL、SmGGPPS、SmHMGS、SmAACT、SmHMGR、SmCPS在SmEIN3過表達株系中的表達水平上調(diào)；在抑制表達株系中的表達水平下調(diào)。丹酚酸途徑中Sm4CL1、SmCYP98A14、SmHPPR、SmRAS在轉(zhuǎn)基因過表達株系中的表達上調(diào)，SmPAL、SmC4H、SmTAT表達下調(diào)

6、。而這些基因在抑制表達株系中表達正好與過表達株系相反。6、酵母單雜交實驗表明SmEIN3和SmHPPR,SmKSL基因的啟動子EBSbox元件結(jié)合，Dual-luciferase實驗表明SmEIN3能正調(diào)控SmDXS2、SmHMGR基因的啟動子，并能負調(diào)控SmTAT基因的啟動子；酵母雙雜實驗表明SmEIN3與SmJAZ1、SmJAZ2L1和SmMYC2這三者均有相互作用。7、HPLC檢測SmEIN3轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹參酮和丹酚酸的含量，結(jié)果顯示，與對照相比，過表達SmEIN3提高丹參酮和丹酚酸的含量；SmE

7、IN3抑制表達株系含量則降低。表明過表達SmEIN3基因能促進丹參酮和丹酚酸的積累。1上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要8、將SmEIN3基因轉(zhuǎn)到模式植物擬南芥中，能夠在轉(zhuǎn)基因擬南芥中觀察到葉片衰老、不抽薹的表型。過表達SmEIN3能提高丹參中丹參酮和丹酚酸代謝產(chǎn)物的含量，Dual-luciferase實驗表明SmEIN3能直接轉(zhuǎn)錄激活HMGR、DXSII等關(guān)鍵酶基因的啟動子，酵母雙雜結(jié)果顯示SmEIN3與SmMYC2和SmJAZs具有相互作用，暗示乙烯信號通路可能與JA信號通路發(fā)生交流，共同調(diào)控丹參中次級代謝

8、產(chǎn)物的合成。關(guān)鍵詞：丹參酮、丹酚酸、生物合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、EIN32上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文AbstractAbstractSalviamiltiorrhizaisaperennialherbwhoserootscanbeusedasmedicine.ThemainactivecomponentsofS.miltiorrhizaarelipid-solubletanshinoneandwater-solublesalvianol