資源描述：
《解淀粉芽孢桿菌cqba03菌株基因組文庫的構建和抗菌相關機制研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、解淀粉芽孢桿菌CQBA03菌株基因組文庫的構建和抗菌相關機制研究重慶大學博士學位論文學生姓名：陳玉龍陳玉龍指導教師：殷幼平教授專業(yè)：植物學學科門類：理學重慶大學生命科學學院二O一五年十一月ConstructionofAGenomicLibraryofBacillusAmyloliquefaciensCQBA03StrainandStudyonMechanismofAntimicrobialActivityAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfo
2、rtheDoctor’sDegreeofScienceByChenYulongSupervisedbyProf.YinYoupingSpecialty:BotanyShoolofLifeSciencesofChongqingUniversity,Chongqing,ChinaNovember,2015中文摘要摘要革蘭氏陰性細菌導致的植物細菌性病害超過250種，此類細菌性植物病害造成大量的植物減產和經濟損失。而柑橘潰瘍病(CitrusBagtedalCankerDisease，CBCD)是其中一種重大植物病害，在超過30個國家廣泛分布，該病能夠造成重大的
3、柑橘業(yè)損失。在疫區(qū)，傳統的柑橘潰瘍病防治方法大多采用銅制劑和農用抗生素，不僅效果不佳，反而造成大量的紅蜘蛛泛濫和抗生素與重金屬離子的超標；對于嚴重發(fā)病的柑橘潰瘍病感染植株，一般只能采取焚燒的方式阻止其擴撒。芽孢桿菌作為一類常用的具有生物防治作用的菌株，對植物病原菌和柑橘潰瘍病有良好的防治效果。對其抗菌基因和抗菌物質的篩選和研究，有利于闡述生物防治機制和高效生防菌的篩選應用。本研究以解淀粉芽孢桿菌CQBA03菌株（BacillusamyloliquefaciensCQBA03）和柑橘潰瘍病病原菌(Xanthomonascitrussubsp.citrus
4、.Xcc)為研究對象，通過構建Fosmid文庫的方式，構建解淀粉芽孢桿菌CQBA03菌株基因組文庫克隆。對其文庫進行誘導、定向篩選，獲得抗柑橘潰瘍病病原菌的克隆。經克隆、測序、生物信息學分析、純化、表達抗菌基因，揭示了該菌株相關抗菌物質的代謝通路并獲得了一種新的分泌型抗菌蛋白。同時以解淀粉芽孢桿菌CQBA03菌株外分泌的D型氨基酸入手，研究了D型氨基酸對柑橘潰瘍病病原菌的變形、致死作用，并且測定了實驗室條件下，D型氨基酸對柑橘潰瘍病的防、治效果。研究為闡述CQBA03菌株抗菌機制和應用提供了理論依據。①解淀粉芽孢桿菌CQBA03菌株基因組Fosmid文
5、庫的構建建立了解淀粉芽孢桿菌CQBA03菌株基因組Fosmid文庫，共獲得約2,3000個文庫克隆。文庫容量920Mb，本文庫容量在CQBA03菌株基因組244~263倍左右,平均容量是解淀粉芽孢桿菌基因組的256倍。隨機外源插入片段為36kb~50kb,平均大小為45kb,其中約40.8%的插入片段大小在31kb到35kb之間,約36.0%的插入片段在35kb到40kb之間?？蛰d率小于1.5%。②抗?jié)儾〔【寺〉墨@得和分析1)通過在牛奶平板篩選培養(yǎng)基上，4℃條件下誘導，從10，000個文庫克隆中，篩選出了66個具有外分泌蛋白酶的文庫克隆。從中我們篩
6、選了1株具有最強外分泌蛋白酶功能的抗柑橘潰瘍病克隆子進行DNA測序。2)將克隆通過454測序后，得到長度為58,785bp的序列，GC=49.13%。經生物信息學分析，預測到344個開放閱讀框。對比后發(fā)現，與已知基因相似的ORF有75個，其中25個基因與抗微生物有關，生理生化相關酶類26個，昆蟲毒性蛋I重慶大學博士學位論文白1個(Insecticidaltoxindomainprotein)；其余23個為功能未知的蛋白質，占總已知序列75個的30%。對所得序列進行代謝通路分析得到24條完整的代謝通路，其中與抗菌相關的通路包括酮的合成與降解（Synthe
7、sisanddegradationofketonebodies），并首次從解淀粉芽孢桿菌基因組獲得12、14和16三種大環(huán)內酯類抗生素生物合成（Biosynthesisof12、14and16-memberedmacrolides）通路。③抗菌基因的獲得、表達、純化1）通過序列分析，篩選出7個可能與抗菌相關的基因序列，經PCR擴增和連接，克隆于PMD19T載體并進行了抗柑橘潰瘍病功能測定。從中篩選出一個抗柑橘潰瘍病的小肽基因，該基因長度132bp(登錄號BankIt1690482)，編碼一個43AA的小肽：其信號位點27-28AA，分子量（Molecu
8、larweight）4772Da，等電點（pI）6.38。通過比對，該基因與線性短桿菌肽酶的縮
