資源描述：
《chifn-γ基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建與瞬時(shí)表達(dá)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,30(6):630～635CN53-1045/NISSN0258-7971JournalofYunnanUniversityChIFN-γ基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建與瞬時(shí)表達(dá)1,21,221吳擁軍,趙德剛,宋莉,許文釗(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽(yáng)550025;2.貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng)550025)摘要:為了使雞干擾素-γ(ChIFN-γ)基因在油菜中獲得高效表達(dá),優(yōu)化了油菜偏愛(ài)的密碼子,在ChIFN-γ的5′端添加Kozark序列,3′端增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽SEKDEL.應(yīng)
2、用同尾酶將人工合成的ChIFN-γ,Napin特異性啟動(dòng)子及信號(hào)肽與NOS終止子克隆到質(zhì)粒pSH中構(gòu)建成植物表達(dá)載體pSH-NGN.經(jīng)生菜瞬時(shí)表達(dá),ELISA檢測(cè)表明ChIFN-γ蛋白獲得有效表達(dá).研究結(jié)果為進(jìn)一步遺傳轉(zhuǎn)化油菜奠定了基礎(chǔ),同時(shí)也對(duì)構(gòu)建基因的正確表達(dá)提供了一種新的快速鑒定方法.關(guān)鍵詞:ChIFN-γ;同尾酶;構(gòu)建;瞬時(shí)表達(dá)中圖分類號(hào):Q786文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0258-7971(2008)06-0630-06干擾素(Interferon,IFN)是一類具有廣泛生物學(xué)生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)量大,通過(guò)添加入飼料或直接作活性
3、的糖蛋白,由英國(guó)科學(xué)家Isaacs和瑞士研究人為口服疫苗喂養(yǎng)家禽,從而達(dá)到預(yù)防治療作[6～8]員Lindenmann于1957年在研究流感病毒干擾現(xiàn)象用.時(shí),在雞胚絨毛尿囊膜發(fā)現(xiàn).它具有較強(qiáng)的免疫調(diào)利用Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的ChIFN-γ序節(jié)、廣譜抗病毒、抗寄生蟲(chóng)和抗腫瘤等多種重要的生列,依據(jù)油菜中使用頻率最高的密碼子優(yōu)化[1,2]理功用,在疫病防治的研究中受到廣泛關(guān)注.ChIFN-γ,人工合成包含Kozark序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)歷史悠久,無(wú)論是雞的品種資源、滯留信號(hào)肽SEKDEL的ChIFN-γ基因,利用同肉蛋制品和生產(chǎn)數(shù)量
4、均名列世界第一.但由于病毒尾酶連接法構(gòu)建含有油菜種子特異性啟動(dòng)子變異快,造成疫苗免疫失效,且新的病毒病不斷產(chǎn)Napin,ChIFN-γ及NOS終止子表達(dá)盒的pSH生,難以控制,特別是全球高致病性禽流感疫情頻-NGN植物表達(dá)載體.采用根癌農(nóng)桿菌EHA105[3]發(fā),每年由病毒病造成的損失約上百億元.研究真空滲透法在生菜中瞬時(shí)表達(dá),ELISA檢測(cè)表達(dá)表明IFN可通過(guò)喉部黏膜吸收,較少分子IFN就的ChIFN-γ蛋白.研究詣在通過(guò)同尾酶構(gòu)建有效可產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫應(yīng)答.由于干擾素不會(huì)出現(xiàn)耐藥的植物表達(dá)載體,瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證ChIFN-γ蛋白能性,
5、對(duì)許多病原微生物具有有效的抑制和防御功否正確表達(dá),為pSH-NGN/EHA105遺傳轉(zhuǎn)化油能,特別是γ-干擾素具有廣譜抗病毒活性和免疫菜,開(kāi)發(fā)ChIFN-γ植物口服疫苗奠定基礎(chǔ).保護(hù)作用,而重組干擾素與天然干擾素又具有同樣1材料與方法的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的活性,因此在生產(chǎn)上有實(shí)際[4,5]的應(yīng)用意義.但目前對(duì)ChIFN-γ表達(dá)方面研1.1材料究較少,且主要以原核細(xì)胞表達(dá)包涵體為主,后處1.1.1植物材料生菜購(gòu)自貴陽(yáng)市花溪農(nóng)貿(mào)市理工藝繁瑣,導(dǎo)致干擾素活性較低,生產(chǎn)成本較高.場(chǎng).而利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)ChIFN-γ具有表達(dá)產(chǎn)物1.1.2菌株
6、及質(zhì)粒質(zhì)粒pSH,E.coliTG1,A-無(wú)需處理就具有生物活性,植物籽實(shí)可長(zhǎng)期貯存、grobacteriumtumefaciensstrainEHA105均為本室收稿日期:2008-04-30基金項(xiàng)目:國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目資助(2007BAD59B06);中國(guó)國(guó)際合作項(xiàng)目資助(2007DFA31260);貴州省優(yōu)秀青年科技基金項(xiàng)目資助(20030312).作者簡(jiǎn)介:吳擁軍,男,河南人,博士生,副教授,主要從事植物基因工程方面的研究.通訊作者:趙德剛,男,貴州人,教授,博士生導(dǎo)師,院長(zhǎng),主要從事植物基因工程方面研究,Email:de
7、gangzhao@yahoo.com.第6期吳擁軍等:ChIFN-γ基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建與瞬時(shí)表達(dá)631保存.1.2.6瞬時(shí)表達(dá)浸染液的制備接種5%的pSH1.1.3主要試劑TaKaRaAgaroseGelDNAPu--NGN/EHA105至含有抗生素的YEB培養(yǎng)基(酵rificationKitVer.2.0,TaKaRaMiniBESTPlasmid母抽提物0.6%,胰蛋白胨0.5%,蔗糖0.5%,硫PurificationKitVer.2.0,DNAMarker為寶生物工酸鎂2mmol/L,卡那霉素50mg/L,利福平20程(
8、大連)公司產(chǎn)品.植物基因組DNA提取試劑盒mg/L)28℃,190r/min,48h;用稀釋液(50為北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;限制性核mmol/L磷酸鹽緩沖液,20μmol/L乙酰丁香酮,含酸內(nèi)切酶、連接酶為Promeger
