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1、分類號密級UDC單位代碼10733甘肅農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文長枝木霉T6發(fā)酵條件優(yōu)化、抑菌活性成分分析及其殺線作用測定StudiesonOptimizationofFermentationConditionsandAntimicrobialActiviveCompositionsandNematicidalActivityoftheFermentationLiquidofT.longibrachiatumT6張建華指導(dǎo)教師姓名徐秉良教授(甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院蘭州730070)學科專業(yè)名稱作物保護研究方向作物病害及其綜合治理論文答辯日期2015年5月30日學位授予日期2
2、015年6月答辯委員會主席李春杰教授評閱人楊成德副教授李繼平研究員2015年5月甘肅農(nóng)業(yè)大學2015屆碩士學位論文摘要長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)是生防木霉屬菌物中的一種,其用于植物病害的生物防治已有報道,但具體的生防機制還未被揭示。長枝木霉T6菌株是從甘肅本地松林土中分離得到的,該菌株不僅對多種病原菌有很好的抑制作用,而且對小麥禾谷孢囊線蟲(Heteroderaavenae)各個蟲態(tài)均具有較強的致死作用。本文對長枝木霉T6的代謝物進行了研究,主要研究結(jié)果如下:1在單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面法對長枝木霉T6菌代謝抑菌物質(zhì)的培養(yǎng)
3、條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明:長枝木霉T6菌代謝抑菌物質(zhì)的最適碳源、氮源分別為4%甘露醇和0.6%蛋白胨。長枝木霉T6菌最優(yōu)培養(yǎng)條件為接種量1.1%、裝液量74.50mL/150mL、發(fā)酵天數(shù)4.0d。在此培養(yǎng)條件下的抑菌率達到96.3%,與理論預(yù)測值96.88%的絕對誤差為0.58%。2在對長枝木霉T6菌培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上,以11種病原菌物為供試菌,研究發(fā)酵液的抑菌活性。結(jié)果表明發(fā)酵液對蘋果樹腐爛病菌(Valsamail)、蘋果斑點落葉病菌(Alternariamali)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的抑制作用最強,分別達95.97%、80.33%
4、和81.97%,對粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)、黑根霉(Rhizopusnigricans)的抑制作用最弱,分別為55.56%、52.61%。以蘋果樹腐爛病菌為指示菌,采用生長速率法測定發(fā)酵液在不同條件下的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性試驗表明:發(fā)酵液耐121℃高溫,耐強酸強堿;自然光及紫外光處理對其抑菌活性無影響;在4℃及常溫下可儲存至少60d以上保持活性不變;長時間微波處理及Zn2+、Fe3+與Fe2+對其影響較大;氧化劑、還原劑在一定濃度內(nèi)對其影響不顯著。3運用萃取、薄層層析、柱層析的方法對長枝木霉T6發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)進行了分離、純化,采用生物活
5、性追蹤的方法,逐步明確了發(fā)酵液中起抑菌作用的成分。試驗結(jié)果表明:采用直接提取法和乙酸乙酯為萃取液的提取物對蘋果樹腐爛病菌和番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)具有最佳的抑制效果,抑制率分別為87.96%和70.04%。石油醚與乙酸乙酯比例達到10:1為最佳薄層層析展開劑。薄層層析展開后利用碘和紫外燈顯色,發(fā)現(xiàn)共有7個點。以不同配比的石油I甘肅農(nóng)業(yè)大學2015屆碩士學位論文醚一乙酸乙酯作為洗脫液,經(jīng)硅膠柱層析分離后得到7個組分,各組分經(jīng)減壓濃縮、揮干溶劑后,分別對各組分的抑菌活性進行測定。選取高活性流分CZ-4進行抑菌成分的GC-MS分析,主要抑菌成分為鄰苯
6、二甲酸二異丁酯(DIBP)、油酸、鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(MEHP)和芥酸酰胺。4以蘋果樹腐爛病菌、蘋果斑點落葉病菌、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、立枯絲核菌、粉紅單端孢為供試菌,測定了活性成分DIBP、油酸、MEHP和芥酸酰胺對供試菌的抑制活性。結(jié)果表明:DIBP對立枯絲核菌、粉紅單端孢有較好的抑制活性,EC50分別為64.7μl/mL、1.8μl/mL。MEHP對蘋果樹腐爛病菌有較好的抑制活性,EC50為40.7μg/mL,油酸、芥酸酰胺對供試病原菌幾乎沒有抑制活性。5研究了不同濃度長枝木霉T6發(fā)酵液對小麥禾谷孢囊線蟲卵孵化的抑制作
7、用和二齡幼蟲的致死作用,并且對發(fā)酵液處理后的卵及二齡幼蟲的形態(tài)特征做了觀察。結(jié)果表明:長枝木霉T6的發(fā)酵液對小麥禾谷孢囊線蟲的卵和二齡幼蟲均具有較強的致死作用。其發(fā)酵液的二倍濃縮液對卵孵化的相對抑制率為46.47%,對二齡幼蟲的校正死亡率為44.45%。顯微觀察結(jié)果表明:長枝木霉T6菌的發(fā)酵液能使線蟲的卵及二齡幼蟲體腔內(nèi)含物發(fā)生消解。關(guān)鍵詞:長枝木霉T6;發(fā)酵液;穩(wěn)定性;活性物質(zhì);分離純化;線蟲II甘肅農(nóng)業(yè)大學2015屆碩士學位論文SummaryTrichodermalongibrachiatumisonespeciesofTrichodermagenustha