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《流行性乙型腦炎病毒單克隆抗體的制備與prm-e蛋白抗原捕獲elisa檢測(cè)方法的建立》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、密級(jí)：論文編號(hào):中囯農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文流行性乙型腦炎病毒單克隆抗體的制備與prM-E蛋白抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立DevelopmentofMonoclonalAntibodiesAgainstJapaneseEncephalitisVirusandEstablishmentofAntigenCaptureELISAforprM-EProteinDetection碩士研究生：王曉s指導(dǎo)教師：華榮虹副研宄員申請(qǐng)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研宄方向：獸醫(yī)微生物及其分子生物學(xué)培養(yǎng)單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院哈爾濱獸醫(yī)研宄所
2、2015年5月密級(jí):論文編號(hào):中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文流行性乙型腦炎病毒單克隆抗體的制備與prM-E蛋白抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立DevelopmentofMonoclonalAntibodiesAgainstJapaneseEncephalitisVirusandEstablishmentofAntigenCaptureELISAforprM-EProteinDetection碩士研究生：王曉磊指導(dǎo)教師：華榮虹副研究員申請(qǐng)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向：獸醫(yī)微生物及其分子生物學(xué)培養(yǎng)單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院哈
3、爾濱獸醫(yī)研究所2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationDevelopmentofMonoclonalAntibodiesAgainstJapaneseEncephalitisVirusandEstablishmentofAntigenCaptureELISAforprM-EProteinDetectionM.S.Candidate：WangXiaoleiSupervisor：AssociateProf.HuaRonghongMajor：P
4、reventiveVeterinaryMedicineSpecialty:VeterinaryMicrobiologyandmolecularbiologyMay2015III摘要流行性乙型腦炎（Japaneseencephalitis，JE）是一種危害嚴(yán)重的蚊媒性人獸共患傳染病，廣泛流行于亞洲大部分地區(qū)和西太平洋地區(qū)，近年來，在澳大利亞北部和巴基斯坦的傳播表明該病的流行范圍在不斷擴(kuò)大。JEV不僅嚴(yán)重威脅人類的健康，而且會(huì)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。建立以單克隆抗體為基礎(chǔ)的抗原抗體檢測(cè)方法則是預(yù)防控制該病毒病的重要手段。本課題組
5、已經(jīng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)JEVprM-E蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，該細(xì)胞系表達(dá)的prM蛋白和E蛋白能夠組裝成與JEV病毒粒子具有近似構(gòu)象結(jié)構(gòu)的病毒樣顆粒（VLP）并分泌至細(xì)胞培養(yǎng)液中。本研究將該細(xì)胞系表達(dá)的JEV-VLP純化后作為免疫原，免疫6～8周齡BALB/c雌鼠，經(jīng)淋巴細(xì)胞雜交瘤融合技術(shù)、亞克隆和間接ELISA方法進(jìn)行篩選后，獲得了8株能穩(wěn)定分泌JEVprM-E蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1B5、3A7、4C6、5B10、5E7、11C2、12D10、18A7。間接ELISA檢測(cè)結(jié)果表明雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體效價(jià)
6、介于1:64~1:2048之間，腹水的抗體效價(jià)介于1:51200~1:204800之間。以HBT試劑盒對(duì)單克隆抗體亞型進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明除12D10株單克隆抗體亞類為IgG2b外，其余7株單克隆抗體亞類均為IgG1，輕鏈均為κ鏈。Westernblot和間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）結(jié)果表明8株單克隆抗體均能夠識(shí)別JEV的天然構(gòu)象表位，5E7還能夠識(shí)別JEV的線性表位。此外，單克隆抗體4C6和12D10為JEV特異性單克隆抗體，與西尼羅病毒prM-E抗原沒有交叉反應(yīng)。JE沒有特異治療方法，疫苗免疫是預(yù)防控制JEV感染的最為有效的措施
7、。JEVprM-E抗原免疫原性強(qiáng)，有望開發(fā)為JE亞單位疫苗。在亞單位疫苗的研發(fā)中，對(duì)疫苗抗原的檢測(cè)是重要的質(zhì)量控制技術(shù)手段。本研究從8株單克隆抗體中篩選出效價(jià)高的5B10和5E7，并將其腹水以ProteinG進(jìn)行了純化。以單克隆抗體5B10作為包被抗體，以單克隆抗體5E7進(jìn)行辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記作為檢測(cè)抗體，并將以凝膠過濾柱層析法純化的JEVprM-E蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)抗原，建立了JEVprM-E蛋白抗原捕獲ELISA方法，用于定量JEVprM-E亞單位疫苗抗原。對(duì)ELISA方法的各個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化后，確定了以下的最佳反應(yīng)條件：
8、包被液為50mmol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液，單克隆抗體5B10包被量為0.6μg/孔，4℃過夜；封閉液為0.5%聚乙烯醇（PVA），37℃封閉2h；待檢抗原以0.5%牛血清白蛋白（BSA）稀釋，37℃反應(yīng)2h；HRP-5E7按1：500比例稀釋，37℃作用1
