家蠅cctζ基因的cdna克隆、表達(dá)及表達(dá)模式研究

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1、中圖分類(lèi)號(hào)：R3單位代碼：丨0660UDC:6I0學(xué)號(hào)：10660S120022學(xué)科專(zhuān)業(yè)代碼i100103密級(jí)：公開(kāi)貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院2015屆碩士研宄生學(xué)位論文(科學(xué)學(xué)位）家蠅CCT?基因的cDNA克隆、表達(dá)及表達(dá)模式研究cDNACloningexpressionandexpressionpatternofCCTgeneinhousefly(Muscadomesticd)研究生：趙學(xué)軍導(dǎo)師：吳建偉教授國(guó)果副教授年級(jí):2012級(jí)專(zhuān)業(yè)：病原生物學(xué)貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)F，獨(dú)v/:進(jìn)行研究.「.作所取得的成果。除了文中特

2、別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)的成果作品。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均己在文中以明確方式標(biāo)明。除與外單位合作項(xiàng)目將予以明確方式規(guī)定外，本研究已發(fā)表與未發(fā)表成果的知識(shí)產(chǎn)權(quán)均歸屬貴陽(yáng)K學(xué)院。本人完全意識(shí)到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。作者簽名（手寫(xiě)）：H導(dǎo)師簽名（手寫(xiě)）：丨服___年廠月7L曰’廠年r月么多II學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全/解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，

3、「彳意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電了?版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院可以將本學(xué)位論文的全部或

4、部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，吋以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬干（請(qǐng)?jiān)谝韵孪鄳?yīng)方框內(nèi)打“V”）：1、保密□，在_年解密后適用本授權(quán)書(shū)。2、不保密作者fe名（f?寫(xiě)）5《乂)孝——導(dǎo)師簽名（-T?寫(xiě)）：—祖年r月zz日丄。if年j?月j

5、中圖分類(lèi)號(hào)：R3單位代碼：10660UDC:610學(xué)號(hào)：10660S120022學(xué)科專(zhuān)業(yè)代碼：100103密級(jí)：公開(kāi)貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院2015屆碩士研究生學(xué)位論文（科學(xué)學(xué)位）家蠅CCTζ基因的cDNA克隆、表達(dá)及表達(dá)模式研究cDNACloning,expressionandexpressionpa

6、tternofCCTgeneinhousefly(Muscadomestica)論文作者：趙學(xué)軍指導(dǎo)教師：國(guó)果副教授申請(qǐng)學(xué)位：醫(yī)學(xué)碩士培養(yǎng)單位：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院學(xué)科專(zhuān)業(yè)：病原生物學(xué)研究方向：醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)分子生物學(xué)研究起止日期：2012年12月至2014年12月論文評(píng)閱人：盲評(píng)答辯委員會(huì)主席：陳建平教授論文答辯日期：2015年5月19日二0一五年五月家蠅CCTζ基因的cDNA克隆、表達(dá)及表達(dá)模式研究專(zhuān)業(yè)：病原生物學(xué)碩士研究生:趙學(xué)軍導(dǎo)師：吳建偉教授國(guó)果副教授【摘要】：目的:從家蠅的EST測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選獲得家蠅的CCT(chaperonincontainingt-com

7、plexpolypeptide)基因MD-CCTζ，上傳GenBank分析分子特性后，進(jìn)行cDNA克隆、表達(dá)；探討MD-CCTζ基因在家蠅不同組織和發(fā)育時(shí)期的時(shí)空表達(dá)模式；初步研究在不同病原微生物和熱脅迫條件下家蠅3齡幼蟲(chóng)的MD-CCTζ基因表達(dá)譜的變化。方法:1、MD-CCTζ的序列分析及cDNA克隆、表達(dá)。從課題組前期構(gòu)建的家蠅幼蟲(chóng)EST數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到家蠅的CCTζ基因序列，通過(guò)序列分析，預(yù)測(cè)其開(kāi)放閱讀框，采用BLAST、EXPASY等生物信息學(xué)網(wǎng)站分析預(yù)測(cè)MD-CCTζ基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域，二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)等；從NCBI上下載其他物種CCTζ基因的氨基

8、酸序列，借助MEGA6.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù);根據(jù)其cDNA序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增MD-CCTζ基因，將目的基因與表達(dá)載體PEASY-E1構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，選擇合適溫度、時(shí)間使用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白，重組蛋白使用His·Tag融合蛋白試劑盒純化。2、家蠅CCTζ基因的時(shí)空表達(dá)分析。分別收集家蠅生活史各發(fā)育階段不同蟲(chóng)態(tài)（卵、1齡幼蟲(chóng)、2齡幼蟲(chóng)、3齡幼蟲(chóng)、蛹），成蟲(chóng)不同性別（雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)）的蟲(chóng)體，提取總RNA后并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RealTimePCR）技術(shù)檢測(cè)MD-C

9、CTζ基因不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異；解剖家蠅3齡幼蟲(chóng)，選擇幼蟲(chóng)的六種具有典型特征的組織器官（脂肪體、唾液腺、中腸、氣管、馬氏管和體壁）。提取相應(yīng)組織的總RNA并轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用RealTimePCR檢測(cè)MD-CCTζ基因的空間表達(dá)差異。3、MD-CCTζ基因在家蠅3齡幼蟲(chóng)脅迫條件下的功能初探。分別將定量的不同病原微生物（白色念珠菌、大腸桿菌和及金黃色葡萄球菌）采用注射法導(dǎo)入到家蠅3齡幼蟲(chóng)體內(nèi)，采用RealTimePCR檢測(cè)誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)（3h、6h、12h、18h、24h、36h、48h）CCTζ基因表達(dá)水平的變化。將3齡幼蟲(chóng)42℃熱脅迫，采用RealT

10、imePCR檢測(cè)脅迫（0h、15min、30min、