基因敲除技術(shù)的運(yùn)用

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1、蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院綜合能力訓(xùn)練Ⅰ——文獻(xiàn)綜述題目：基因敲除技術(shù)研究進(jìn)展作者：蔣成學(xué)號(hào)：201207749指導(dǎo)教師：謝放完成日期：2014-7-16基因敲除技術(shù)研究進(jìn)展摘要：本綜述主要闡明基因敲除技術(shù)近幾年來的方法和步驟，以及在真核生物和原核生物中的具體實(shí)施，并運(yùn)用實(shí)例形象闡明基因敲除技術(shù)的作用，以及其在國(guó)內(nèi)的發(fā)展和以后基因敲出技術(shù)的發(fā)展前景，和一些在運(yùn)用基因敲除技術(shù)過程中的問題。關(guān)鍵字：基因敲除原核中斷系統(tǒng)真核中斷系統(tǒng)絲狀真菌基因敲除1.引言：1.1概念：基因敲除是80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來的。80年代初，胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除

2、的技術(shù)基礎(chǔ)[1]。1985年，首次證實(shí)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎(chǔ)。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細(xì)胞基因敲除的小鼠模型[2]。直到現(xiàn)在，運(yùn)用基因同源重組進(jìn)行基因敲除依然是構(gòu)建基因敲除動(dòng)物模型中最普遍的使用方法。2012年初的敲除決定表面抗原的豬的模型的成功建立更是為異種器官移植排除了一道重要的障礙，展示了基因敲除技術(shù)的美好前景?？傊?基因敲除已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究的最熱點(diǎn)與最前沿，并已對(duì)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的許多研究領(lǐng)域產(chǎn)生深刻的影響，成為革命性的研究工具,具有極其重要的理論意義和實(shí)踐意義[1,3]。基因敲除是借助分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和動(dòng)物胚胎

3、學(xué)的方法,通過胚胎干細(xì)胞[2]這一特殊的中間環(huán)節(jié)將小鼠的正常功能基因的編碼區(qū)破壞,藉以揭示基因功能最直接的手段之一,因此成為后基因組時(shí)代的重要研究方法和內(nèi)容。通常意義上的基因敲除主要是應(yīng)用DNA同源重組原理[3]，用設(shè)計(jì)的同源片段替代靶基因片段，從而達(dá)到基因敲除的目的。1.2基本步驟：a.基因載體的構(gòu)建：目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標(biāo)記基因，TK基因等)的載體上，成為重組載體。b.ES細(xì)胞的獲得：現(xiàn)在基因敲除一般采用是胚胎干細(xì)胞，最常用的是鼠，而兔，豬，雞等的胚胎干細(xì)胞也有使用。而最常用的鼠的種系是129[4]及其雜合體，因?yàn)檫@類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸

4、胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。c.同源重組：把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標(biāo)記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中，從而得以表達(dá)。d.選擇篩選已擊中的細(xì)胞：一般地，篩選使用正、負(fù)選擇法，比如用G418篩選所有能表達(dá)neo基因的細(xì)胞，然后淘汰所有HSV-TK正常表達(dá)的細(xì)胞，剩下的細(xì)胞為命中的細(xì)胞。將篩選出來的靶細(xì)胞導(dǎo)入鼠的囊胚中，再將此囊胚植人母鼠體內(nèi)，使其發(fā)育成嵌合體小鼠[2,6]。e.表型研究：通過觀察嵌體小鼠的生物學(xué)形狀的變化進(jìn)而了解目的基因變化

5、前后對(duì)小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達(dá)到研究目的基因的目的。f.得到純合體：由于同源重組常常發(fā)生在一對(duì)染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，需要進(jìn)行至少兩代遺傳。1.3其他基因敲出技術(shù)1.3.1.條件性基因敲除法條件性基因敲除法可定義為將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法[4]。它實(shí)際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶Cre干預(yù)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，在對(duì)小鼠基因修飾的時(shí)空范圍上設(shè)置一個(gè)可調(diào)控的“按鈕”，從而使對(duì)小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可控狀態(tài)[3]。1.3.2誘導(dǎo)性基因敲除法誘導(dǎo)性基因敲除也是以Cr

6、e/loxp系統(tǒng)為基礎(chǔ)，但卻是利用控制Cre表達(dá)的啟動(dòng)子的活性或所表達(dá)的Cre酶活性具有可誘導(dǎo)的特點(diǎn)，通過對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的控制或利Cre基因定位表達(dá)系統(tǒng)中載體的宿主細(xì)胞特異性和將該表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)的過程在時(shí)間上的可控性，從而在1oxP動(dòng)物的一定發(fā)育階段和一定組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因進(jìn)行遺傳修飾之目的的基因敲除技術(shù)。人們可以通過對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的預(yù)先設(shè)計(jì)的方式來對(duì)動(dòng)物基因突變的時(shí)空特異性進(jìn)行人為控制、以避免出現(xiàn)死胎或動(dòng)物出生后不久即死亡的現(xiàn)象。1.3.3利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除此法利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶

7、隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。2.基因敲除技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀2.1原核生物中基因敲除技術(shù)的應(yīng)用2.1.1基因敲除技術(shù)在絲狀真菌中的研究現(xiàn)狀（1）載體構(gòu)建利用PCR技術(shù)輔助構(gòu)建打靶載體[7]可以快速獲得目的片段，即大腸桿菌質(zhì)?；?。（2）載體中加入特殊的結(jié)構(gòu)元件或采用特殊的報(bào)告基因,在打靶載體中，加入非同重組選擇標(biāo)記是提高篩選效率的一種非常有效的方法.（3）構(gòu)建高同源重組率