ELISA檢測抗體

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1、第四次試驗ELISA法血清抗體檢測免疫膠體金法檢測早早孕免疫學教研室※重點實驗※(寫實驗報告）&血清抗體的檢測：第一周：免疫小鼠（腹腔注射5%綿羊紅細胞SRBC)、EILISA板抗原包被以及封閉第二周：小鼠眼球取血分離血清(96h后已經產生特異性抗體，存在血清中）第四周：ELISA實驗檢測血清中抗體水平（ELISA后續(xù)步驟）成績課堂表現及出勤情況，占5分實驗報告，占10分期末考試，占10分復習第一次課操作SRBC凍融稀釋（得到比例適當的抗原，非完整的紅細胞）↓每孔加包被液（碳酸鹽緩沖液，含抗原）100μl,37℃1h（包被）↓棄去孔中液

2、體，用PBS洗板3次，每次均拍板↓加封閉液，每孔200μl，37℃，30min（封閉）↓棄去孔中液體，用PBS洗板3次，排干后4度保存包被和封閉ELISA板（復習）包被和封閉是ELISA前兩個步驟，第一次課已經完成。包被就是將已知抗原或抗體非特異性，物理性吸附于固相載體表面并保持其免疫學活性。封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而防止在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。洗滌：不論是包被還是封閉后，我們都用PBST洗液洗滌三次，目的是去除游離的未結合的物質，從而保證試驗結果的特異性及穩(wěn)定性。陽性陽性陰性待測一陰性待測一待測二待

3、測二1待測一本組待測血清樣本1:20稀釋，待測二鄰組待測血清樣本1:20稀釋。21:20稀釋50μl待測血清+950μlPBS3每孔加對應液體（注意混勻）100μl，陽性孔和陰性孔分別加入100μl的陽性、陰性對照液。加不同液體注意更換槍頭，不要串孔。并做好標記5統一放入37度孵箱1h（大于1h)ELISA步驟包被↓封閉↓加入待測樣本↓加入酶標二抗↓加入底物↓加入終止液，終止反應加入酶（HRP）標記二抗1棄液2用PBS洗板3次，200μl/每孔，每次一分鐘以上，水平輕微晃動，切勿串孔、溢出。每次洗完用濾紙拍板，拍干。3于8個ELISA孔中

4、加入酶（HRP)標記二抗，100μl/每孔。4加完后統一放入37度溫箱1h(大于1h)。加入底物-酶促反應-反應終止1棄液2用PBS洗板7次，200μl/每孔，每次一分鐘以上，水平輕微晃動，切勿串孔、溢出。每次洗完用濾紙拍板，拍干。3于8個ELISA孔中分別加入底物100μl/每孔。4加完后，室溫避光反應10min。5反應10min后，于8個ELISA孔中分別加入終止液，50μl/每孔。標記抗體技術是在抗體球蛋白分子上，連接某一個特定的、容易檢測的分子或原子(標記物)，利用標記抗體能與相應抗原結合的特性，通過標記物的檢測，從而確定抗原的存

5、在部位。標記抗體技術目前廣泛應用的主要有熒光抗體、酶標記抗體和同位素標記抗體等。此外尚有鐵蛋白標記抗體，主要用于免疫電鏡的技術，在亞細胞水平上進行抗原定位。基本類型放射性核素標記技術免疫熒光技術免疫酶技術1.免疫熒光技術即免疫熒光細胞組織化學技術，是根據抗原抗體反應的原理，采用熒光素標記的已知抗體作為探針，檢測待測組織、細胞標本中的靶抗原，形成的抗原-抗體復合物上帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，發(fā)出明亮的熒光，這樣就可以分辨出抗原（或抗體）的所在位置及其性質，并可利用熒光定量技術計算抗原的含量，以達到對抗原物質定位、定性和定量測定的目的。分為

6、直接法、間接法、補體法、雙重免疫熒光染色。方法1、直接法：這是最早的方法。其基本原理是用已知的抗體標記上熒光素后成為特異性熒光抗體，染色時將該抗體直接滴在載玻片上進行孵育，使之直接與載玻片上的抗原結合，在熒光顯微鏡下直接觀察，作出判斷。該方法評價：簡單易行、特異性高、快速方便，常用于腎活檢組織幾種免疫球蛋白的檢測和病原體的檢測。但其不足是只能檢測相應的一種物質，敏感性較差，效果有時不理想，目前較少作為更多方面的檢測。2、間接法：該法的基本原理是用特異性的抗體與切片中的抗原結合后，繼用間接熒光抗體，與前面的抗原抗體復合物結合，形成抗原抗體熒

7、光復合物。在熒光顯微鏡下，根據復合物的發(fā)光情況來確定所檢測的抗原。該方法評價：由于結合在抗原抗體復合物上的熒光素抗體增多，發(fā)出的熒光亮度強，因而其敏感性強。目前本法應用較廣泛，只需制備一種種屬熒光抗體，即可適用于多種第一抗體的標記顯示。方法3補體法：是間接法的改良。它是采用特異性抗體同新鮮補體混合后再與切片上的抗原反應，補體就結合在抗原-抗體復合物上，再用抗補體的熒光抗體與補體結合，形成抗原-抗體-補體-抗補體熒光抗體復合物。這種方法不僅具有間接法的敏感性，而且熒光抗體不受免疫血清的動物種屬限制，一種熒光抗體就能檢測所有的抗原抗體系統；缺

8、點是較間接法更容易出現非特異性染色，且補體不穩(wěn)定，每次均要采取新鮮血清，操作上比較麻煩。4雙重免疫熒光染色：即可在同一標本上定位定性檢測兩種抗原。如A抗原的抗體用熒光素羅丹明標記，呈橘紅色，而