人表皮干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及鑒定

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1、人表皮干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定何黎顧華昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚性病科云南[摘要]目的：探索實(shí)驗(yàn)條件下人表皮干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定。方法：利用細(xì)胞工程方法進(jìn)行組織分離及細(xì)胞培養(yǎng)：通過免疫組化方法，利用角蛋白單克隆抗體對(duì)培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并利用表皮干細(xì)胞的相對(duì)特異標(biāo)識(shí)分子——CK19對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果：表皮自真皮較完整分離，電鏡及免疫組化證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為角質(zhì)形成細(xì)胞，免疫組化結(jié)果顯示：CK反應(yīng)陽性，部分細(xì)胞CK19陽性，表明有表皮干細(xì)胞存在。結(jié)論：體外分離、培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞成功，且分離得到的角質(zhì)形成細(xì)

2、胞中有表皮干細(xì)胞存在。[關(guān)鍵詞]：角質(zhì)形成細(xì)胞表皮干細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)角蛋白——19對(duì)于燒傷、急性創(chuàng)傷、某些疾病導(dǎo)致的皮膚缺損，尤其是大面積燒傷一直以自體皮移植作為首選方案，而自體皮膚不足是臨床遇到的主要問題。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和組織工程的出現(xiàn)，使許多臟器或組織體外重建成為可能。人工皮膚的研制就是一個(gè)典型例子。在這一技術(shù)中，種子細(xì)胞——角質(zhì)形成細(xì)胞的體外培養(yǎng)，以及體外分離到的角質(zhì)形成細(xì)胞中是否有在體外能大量增殖的表皮干細(xì)胞決定了能否成功構(gòu)建人工皮膚。為此本課題采用組織分離方法及細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行角質(zhì)形成細(xì)胞體外分離及培養(yǎng)；通過免疫

3、組化方法，利用人廣譜單克隆抗體對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定；并利用CK19對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞中是否有表皮干細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。材料和方法一、材料1、取材選擇6-26歲健康男性，行包皮環(huán)切術(shù)切除的包皮。2、主要培養(yǎng)基及試劑(1)磷酸鹽緩沖溶液（PBS和D-Hank’s液）：（2）培養(yǎng)基：K-SFM（Gibco公司），編號(hào)：37010，內(nèi)含2.5ug表皮細(xì)胞生長因子（EGF）和25mg小牛垂體(BPE)：（3）分離酶：dispase（4）胰蛋白酶；（5）抗人廣譜角蛋白單克隆抗體；（6）CK19單克隆抗體；（7）SP超敏免疫組化試劑盒。二、方法1

4、、取材將包皮環(huán)切術(shù)切除的健康包皮組織放入50ml離心管中（內(nèi)裝10mlDMEM培養(yǎng)基，含青、鏈酶素及硫酸慶大酶素）。1、角質(zhì)形成細(xì)胞的分離將手術(shù)切除的包皮組織剪截成0.5大小皮片,75%酒精漂洗3次后，用含硫酸慶大酶素的PBS重復(fù)漂洗3次，再用PBS沖洗3-5次,放入裝有10mldispase酶的離心管中放入4℃冰箱過夜。次日晨，用無菌彎頭眼科鑷輕輕揭下表皮，放入含有5ml0.05%胰酶及0.01%EDTADE的50ml離心管，置于37℃消化吸收10min，加入含有15%小牛血清的DMEM終止消化，濾網(wǎng)過濾殘?jiān)?，將濾下的

5、液體離心，棄上清，在加入不敷出10MLK-SFM培養(yǎng)基充分混勻后再離心一次，棄上清，加入5ml完全K-SFM培養(yǎng)基，用液管充分吹散細(xì)胞團(tuán)。2、細(xì)胞計(jì)數(shù)將10ul細(xì)胞懸液與10ul臺(tái)盼藍(lán)充分混勻后，于計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，每次收集到的細(xì)胞總在1×1之間，細(xì)胞活率>90%以上。4、角質(zhì)形成細(xì)胞原代培養(yǎng)將制備的角質(zhì)形成細(xì)胞懸液以1的密度接種到25塑料培養(yǎng)瓶中，置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48小時(shí)后換液，以后每3天換液一次。5、角質(zhì)形成細(xì)胞的傳代培養(yǎng)當(dāng)原代培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞鋪滿瓶底約80%左右時(shí)，棄培養(yǎng)基，加入0.05%胰蛋白酶和0.01%

6、EDTA混合液，約3-5min后加入含15%牛血清的DMEM終止消化，然后離心棄上清，加入10完全K-SFM培養(yǎng)基,記數(shù)后按的密度接種到25塑料培養(yǎng)瓶中,置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2-3天換液一次.代長滿培養(yǎng)瓶約80%后,重復(fù)上述步驟繼續(xù)傳代培養(yǎng).6角質(zhì)形成細(xì)胞的鑒定(1)倒置顯微鏡觀察將原帶代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞接種之后,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及動(dòng)態(tài)變化,并于培養(yǎng)后1天3天5天7天9天11天照相.(2)透射電子顯微鏡觀察將傳代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞按常規(guī)方法處理后,置于100C-X透射電子顯微鏡下觀察并照相.(3)免疫組化

7、染色將原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞懸液進(jìn)行免疫組化染色.以光譜的鼠抗人角蛋白單克隆抗體及CK19分別作為一抗,以PBS作為陰性對(duì)照.結(jié)果1.角質(zhì)形成細(xì)胞的分離及培養(yǎng)取出經(jīng)dipase酶消化后的包皮組織,行HE染色,組織形態(tài)學(xué)觀察顯示:表皮自真皮分離較完整,表皮基底層中細(xì)胞基本完整.2、倒置顯微鏡觀察結(jié)果于培養(yǎng)的第1、3、5、7、9、11天倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并照相3、透過電鏡下觀察結(jié)果電鏡下細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞內(nèi)可見大量的束狀張力細(xì)絲，證實(shí)為角質(zhì)形成細(xì)胞：且其間可見少量的較為幼稚的角質(zhì)形成細(xì)胞（細(xì)胞體積較小。細(xì)胞核大，

8、核仁明顯，常染色質(zhì)豐富，異染色質(zhì)教少，胞漿可見少量的張力細(xì)絲及較豐富的線粒體）4、免疫組化染色結(jié)果利用抗角蛋白單克隆抗體對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定，細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，證實(shí)為人角質(zhì)形成細(xì)胞：CK19免疫組化染色顯示，有少量CK19陽性細(xì)胞存在，并以PBS作為一抗設(shè)置陰性對(duì)照。討論人正常皮膚的表皮細(xì)胞包括角質(zhì)形成細(xì)胞、黑