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1、人熱休克蛋白72基因的克隆、原核表達(dá)與純化作者：余厚友 宋祖軍 袁順書 劉彥仿 楊守京【關(guān)鍵詞】肝腫瘤關(guān)鍵詞:肝腫瘤;細(xì)胞株;熱休克蛋白72;克隆;基因表達(dá)摘要:目的克隆人熱休克蛋白72（HSP72）基因，原核表達(dá)并純化蛋白產(chǎn)物，以探討其生物學(xué)功能.方法從熱休克的人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中，用RT-PCR方法擴(kuò)增得到HSP72基因并克隆到原核表達(dá)載體pQE-30中，在大腸桿菌JM109中用IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)的蛋白經(jīng)FPLC梯度洗脫和SephacrylS200凝膠過(guò)濾純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到NC膜上，用anti-HSP72單抗作探針，進(jìn)行Weste
2、rnblot鑒定.結(jié)果克隆的基因序列分析結(jié)果與有關(guān)報(bào)道一致，所構(gòu)建的pQE-30HSP72載體在大腸桿菌中表達(dá)出與預(yù)期大小相符的Mr為72000的蛋白，經(jīng)鑒定確系HSP72蛋白.結(jié)論克隆了人HSP72基因，并對(duì)該基因進(jìn)行了原核表達(dá)與純化，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了良好基礎(chǔ). Keywords:liverneoplasms;cellline;heatshockprotein72;cloning;geneexpression Abstract:AIMToclonehumanheatshockprotein72（HSP72）gene，doprokaryotice
3、xpressionandpurifyHSP72protein9forfurtherstudy.METHODSHumanHSP72genewasobtainedbyRT-PCRfromheatshockedhumanhepato-carcinomacelllineSMMC-7721.ItsproductwasrecombinedinvitrowithprokaryoticexpressionvectorpQE-30andwas transformedtoE.colistrainJM109.Theproteins，expressedinE.colistrainwith
4、HSP72recombinantplasmidunderIPTGinduction，wasobtainedbyFPLCandSephacrylS200chro-matographyandcharacterizedbySDS-PAGEandWestern-blot-confirmedwithanti-HSP72McAb.RESULTSTheHSP72genewasclonedandidentifiedtobeconsistentwithrelevantreports.TheHSP72withamolecularweightof72000washighlyexpres
5、sedinpQE-30HSP72.WesternblotprovedthattheexpressedproducthadtheantigenicityofHSP72.CONCLUSIONTheestablishmentofaseriesofmethodsforthecloning，expressionandpurificationofHSP72genewillassistinthestructuralandfunctionalchar-acterizationofHSP72. 0引言9 熱休克蛋白（HSP）是生物體（或離體的培養(yǎng)細(xì)胞）在不良環(huán)境因素作用下（如缺
6、血、缺氧、重金屬離子、氨基酸類似物、病毒感染、DNA損傷等）所產(chǎn)生的一組特殊蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)胞損傷有保護(hù)作用.其生物學(xué)功能很廣泛，在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化過(guò)程中參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、折疊、跨膜運(yùn)輸、分解和立體構(gòu)象的維持并發(fā)揮重要作用，屬分子伴侶蛋白［1］.熱休克蛋白72（HSP72）是HSP中最保守和最主要的一類.近年來(lái)發(fā)現(xiàn)很多疾病的發(fā)生、發(fā)展均與其有關(guān)，有必要進(jìn)一步了解其生物學(xué)功能.我們克隆了人HSP72基因，并在大腸桿菌內(nèi)對(duì)該基因進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，建立了一套完備的純化方法，為進(jìn)一步研究提供了條件. 1材料和方法 1.1材料人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721和受體菌
7、JM109由本室保存.測(cè)序質(zhì)粒載體pUC19和原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-30由中山醫(yī)科大學(xué)葉苓博士惠贈(zèng).EcoRI，PstI，T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶購(gòu)自NSBCSangon公司.DNAMarker、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和anti-HSP72單抗購(gòu)自Gibco公司.IPTG、細(xì)胞總RNA提取試劑盒和質(zhì)粒提取純化試劑盒為Promega公司產(chǎn)品.cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)于華美生物公司. 1.2方法 1.2.1PCR引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GeneBank中已報(bào)道的人HSP72基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，并在片段的5’及3’端序列引入HSP72基因內(nèi)部沒(méi)有的
8、新的酶切位
