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1、西北大學(xué)碩士學(xué)位論文小麥鹽脅迫應(yīng)答基因cDNA的克隆與序列分析姓名：龔莉桂申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：徐子勤20030501小麥鹽脅追應(yīng)答基因cDNA的克隆與序列分析摘要本研究以西農(nóng)88小麥幼苗葉片為材料，利用DDRT—PcR(DifferentialDisDlavReverseTranscription—P01yTnerasechainReaction，差異顯示反轉(zhuǎn)錄PcR)技術(shù)對(duì)在正常條件下與鹽脅迫條件下小麥葉片基因表達(dá)的差異進(jìn)行分析以期找到有價(jià)值的耐鹽相關(guān)基因。從1％Nacl處理72h的小麥幼苗葉片提取純化mRNA，經(jīng)過(guò)錨定引物Oligo
2、(dT)12Gc反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，用10個(gè)堿基隨機(jī)引物進(jìn)行二次PcR擴(kuò)增，經(jīng)1．5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到24條差異cDNA片段，包括9條誘導(dǎo)表達(dá)片段、2條增強(qiáng)片段和13條抑制表達(dá)片段。對(duì)12條差異較明顯的cDNA片段進(jìn)行了克隆，對(duì)其中的wSR2、WSRl、W蹄b三個(gè)克隆進(jìn)行了序列測(cè)定和同源性對(duì)比分析。Northern印跡分析結(jié)果顯示wSR2片段存在明顯的脅迫抑制表達(dá)特征，即處理材料有較弱的雜交信號(hào)，未處理材料有較強(qiáng)的雜交信號(hào)。GenBank／BLAsT檢索發(fā)現(xiàn)wsR2與編碼木酮糖激酶(L—xyluloseKinase)的LyxK基因核甘酸序列有99
3、％相似性。wSR2與木酮糖激酶基因的高度同源性說(shuō)明wsR2可能參與了光合作用中的暗反應(yīng)過(guò)程，并在暗反應(yīng)過(guò)程中起抑制作用，對(duì)它的克隆和表達(dá)分析為認(rèn)識(shí)植物磷酸戊糖途徑和光合作用的暗反應(yīng)過(guò)程提供了新的證據(jù)。wSRl與wSR3探針與鹽脅迫條件下培養(yǎng)的小麥葉片RNA雜交時(shí)均表現(xiàn)出陽(yáng)性雜交信號(hào)，而無(wú)鹽脅迫時(shí)沒(méi)有雜交信號(hào)。wSRl與人血管生成素抑制因子編碼序列具有高度同源性，推測(cè)wsRl對(duì)應(yīng)基因的編碼產(chǎn)物可能作為一種RNA酶抑制因子起作用，通過(guò)保護(hù)某些RNA分子來(lái)調(diào)節(jié)翻譯過(guò)程，使小麥細(xì)胞對(duì)鹽脅迫做出防御性應(yīng)答。小麥wsRl片段與人和動(dòng)物血管生成素抑制因子編碼序列的高度一
4、致性表明它們可能是生命演化過(guò)程中出現(xiàn)最早的基因，反映出動(dòng)植物細(xì)胞在抵抗逆境方面具有一些共同的機(jī)制。wSIu與^b珊D躕p把珊BACcloneRPll-399D2(肋m4，complctesequence)的一段核甘酸序列同源性高達(dá)100％，進(jìn)一步說(shuō)明植物與動(dòng)物基因組具有某些共同的編碼序列，可能在基因表達(dá)方面具有一些共同的機(jī)制，wSR3序列可能是動(dòng)植物生命演化過(guò)程中的保守序列。小麥鹽脅迫應(yīng)答基因cDNA片段的獲得，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)理解鹽脅迫應(yīng)答機(jī)理提供了新證據(jù)。關(guān)鍵詞：小麥鹽脅迫差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR總RNANonhem雜交LyxK基因血管生成素抑制因子人類4號(hào)染
5、色體RPll．399D2BAcCloningandsequenceanalysesofcDNAfragmemtsencodingsalt—respondinggenesf}omwheatAbstractTheobjectofthisStudyislookjngforthesalt—respondinggenes舶mtlleleavesofwheat(xinong88)seedlingsgro、Ⅳinginnollnalorsalt．蚰ressconditionsbyDi行efe塒alDisplayRT．PCR(DDRT-PCR)methodrr瓜NAs啪s
6、isolatcda11dp砸fied舶mleavesofwheatseedlin筍仃eated謝th1％NaClfor72hollrs．Thefirststra堇ldofcDNAwassynthesizedViareVersetranscriptiOnwithanchorprimer0ligo(dT)12GC．PCR鋤plificationwascarriedout謝th10bp姍domprimersfortwotimes，andtherc—amplifredp州uctswereseparatedin1．5％agamsegel．T1礬
7、ntyfbIlrdi
8、仃eremialcDNA施gmems，includiIlgIlineinductiVeexpression觸gmems，鉚ojntensjve覦gmentsa11dthjrf。eni】111ibito叮exl)ression脅gmcntsweredetectcd．T、velvccDNA脅gmems謝thobviousdi肫rencewerecloned．Sequence鋤alysesandh哪01090uscomp撕sonsofWSR2、WSRl、WSR3werecarriedout．ThefcsultofNonllemblo砸ngexhibitedt脅W
9、SR2劬grnemhadobviollssaltiIl}libit
